易秋分，張翠英，蔣永吉，唐昭娜，陳文成，朱顯明，劉俊偉，董 輝

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457)

谷胱甘肽親和層析介質(zhì)的制備條件及其層析特性研究

易秋分1,2，張翠英1，蔣永吉1,2，唐昭娜1,2，陳文成1,2，朱顯明1,2，劉俊偉2，董 輝2

(1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457)

以瓊脂糖凝膠4FF(Sepharose 4 Fast Flow)為基質(zhì)，1，4-丁二醇二縮水甘油醚(BDGE)為活化劑，通過活化、偶聯(lián)谷胱甘肽(GSH)，得到GSH親和層析介質(zhì)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：活化及偶聯(lián)的優(yōu)化條件為10,mL基質(zhì)加入0.42,g NaOH、15,mL 二甲基亞砜(DMSO)、15,mL BDGE，反應(yīng)溫度為40,℃，反應(yīng)時間為6,h；偶聯(lián)溶液pH 6.5，反應(yīng)溫度為37,℃，反應(yīng)時間為24,h．在此條件下，環(huán)氧基修飾密度可達(dá)60～65,μmol/mL；所制備的介質(zhì)載量為(14.19± 0.98)mg/mL．以此介質(zhì)對谷胱甘肽S–轉(zhuǎn)移酶(GST)、融合蛋白GST-Bcl-2、GST-Ald、GST-PTPN12進(jìn)行純化，結(jié)果表明，該介質(zhì)純化效果較好、載量高、穩(wěn)定性能較好，可重復(fù)使用．

谷胱甘肽親和層析；活化；環(huán)氧基修飾密度；載量

在外源基因的表達(dá)中，為了更好地獲得人們所需要的重組蛋白產(chǎn)物，需要通過分離純化獲得高純度、高活性的產(chǎn)物．為了簡化分離純化手續(xù)和降低成本等，專家學(xué)者已作了大量研究，其中融合表達(dá)載體的使用使上述問題得到一定程度的改善，標(biāo)簽技術(shù)的應(yīng)用，為提供高純度、高活性的基因工程產(chǎn)品創(chuàng)造了更有利的條件[1]．親和層析技術(shù)具有分離效率高、特異性強(qiáng)、活性損失率低和操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在分離純化蛋白質(zhì)藥物、抗體等生物活性大分子中的應(yīng)用十分廣泛[2]．谷胱甘肽–S–轉(zhuǎn)移酶融合表達(dá)系統(tǒng)是通過大腸桿菌進(jìn)行蛋白表達(dá)、純化和檢測的重要系統(tǒng)．通過這一系統(tǒng)表達(dá)的蛋白一般在N末端融合上可溶性谷胱甘肽–S–轉(zhuǎn)移酶作為標(biāo)簽．由于谷胱甘肽–S–轉(zhuǎn)移酶與谷胱甘肽(GSH)能夠特異性的結(jié)合，因此可以通過固定化谷胱甘肽層析介質(zhì)對谷胱甘肽–S–轉(zhuǎn)移酶融合蛋白進(jìn)行分離、富集和純化[3]．

GSH瓊脂糖凝膠4FF(Sepharose 4 Fast Flow)親和層析填料是一種常用的固定化谷胱甘肽層析介質(zhì)，主要由基質(zhì)、連接臂和配基組成．目前，GSH親和層析介質(zhì)的生產(chǎn)主要依賴進(jìn)口(如GE Healthcare的Glutathione Sepharose系列，以下簡稱GE介質(zhì))，該填料在國內(nèi)處于壟斷地位，價格較為昂貴，這樣不利于實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模使用，因此開發(fā)一種適用的國產(chǎn)替代產(chǎn)品將非常有意義[4]．

親和層析介質(zhì)的制備過程涉及到空白介質(zhì)的活化、配基的偶聯(lián)、封閉介質(zhì)上未偶聯(lián)配基的環(huán)氧基團(tuán)、清洗保存等步驟．其中介質(zhì)活化及配基偶聯(lián)過程是影響介質(zhì)載量的關(guān)鍵因素，終止偶聯(lián)反應(yīng)、封閉未發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的環(huán)氧基團(tuán)能避免在親和層析中引入非特性吸附．介質(zhì)的中間活化可使用環(huán)氧氯丙烷(ECH)、1，4–丁二醇二縮水甘油醚(BDGE)、N–羥基丁二酰亞胺、溴化氰、戊二醛、烯丙基溴等活化試劑，不同的活化方法引入不同長度和類型的連接臂，連接臂長度過短可加大空間位阻的影響，而過長則不利于GSH偶聯(lián)以及配基和配體的親和．陳成等[5]完成了BDGE活化、偶聯(lián)GSH、乙醇胺溶液終止偶聯(lián)反應(yīng)的介質(zhì)制備過程．研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧氯丙烷的低水溶性和活化過程中環(huán)氧基水解制約了活化效率，史清洪等[6]引入親水試劑二甲基亞砜(DMSO)可消除瓊脂糖凝膠與環(huán)氧氯丙烷之間的相界面，促進(jìn)活化試劑的溶解，提高了瓊脂糖色譜介質(zhì)中環(huán)氧基的修飾密度，并通過對ECH濃度、NaOH濃度及反應(yīng)時間的優(yōu)化，得出最大環(huán)氧基修飾密度下的最佳活化反應(yīng)條件．金華雄等[7]通過使用ECH和BDGE兩種不同長度的連接臂，然后偶聯(lián)還原型谷胱甘肽，得到兩種谷胱甘肽親和層析介質(zhì)，認(rèn)為兩種自制介質(zhì)都能達(dá)到純化要求，但是由于BDGE活化引入的連接臂較長，空間位阻較小，有利于蛋白吸附，回收率是ECH活化的2倍，且純化效果更佳．馮靜等[8]系統(tǒng)考察了活化時間、偶聯(lián)時間和偶聯(lián)溶液pH對瓊脂糖介質(zhì)表面上配基偶聯(lián)位點(diǎn)的影響．蛋白在偶聯(lián)過程中受環(huán)氧基密度影響較大，密度越高，偶聯(lián)位點(diǎn)多；偶聯(lián)12,h以后偶聯(lián)蛋白量不再增加．偶聯(lián)溶液pH影響偶聯(lián)蛋白二級結(jié)構(gòu)，一定范圍內(nèi)隨著pH增加，偶聯(lián)蛋白量增多．

為尋求一種經(jīng)濟(jì)、簡便、高效、穩(wěn)定的GSH層析介質(zhì)的制備方法，本文以瓊脂糖凝膠4FF為基質(zhì)，BDGE為連接臂，引入DMSO親水性試劑，制備GSH親和層析介質(zhì)，重點(diǎn)對凝膠顆粒的活化條件、GSH偶聯(lián)溶液的pH進(jìn)行了優(yōu)化，對GST標(biāo)簽蛋白，融合蛋白GST-Bcl-2、GST-Ald、GST-PTPN12進(jìn)行純化．

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與儀器

分別含表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-1、pGEX-Bcl-2、pGEX-Ald、pGEX-PTPN12的宿主菌大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，GST蛋白及GST融合蛋白片段相對分子質(zhì)量分別為2.6×104、6.0×104、6.5×104、6.8×104，均由本實(shí)驗(yàn)室保存．

瓊脂糖凝膠4FF、Prescission Protease，GE Healthcare公司；1，4–丁二醇二縮水甘油醚(BDGE)，瑪雅試劑；二甲基亞砜(DMSO)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、還原型谷胱甘肽、十二水合磷酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、酚酞、硫代硫酸鈉、無水氫氧化鈉、氯化鈉、無水合硫代硫酸鈉、磷酸二氫鉀，上海生工生物工程有限公司；95%,乙醇，天津市盛迪達(dá)貿(mào)易有限公司；濃磷酸、濃鹽酸，西隴化工股份有限公司．

Elix 3 & Milli–Q型純水儀，Millpore公司；PB-10型pH計，Sartorous公司；V410型無油真空泵，德國Chemvak公司；SIIZ–Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；JA5003型精密電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；ZHWY–211C型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；?KTA explorer 10,S、?KTA HPLC蛋白純化系統(tǒng)，GE Healthcare公司；蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司．

1.2 方法

1.2.1 瓊脂糖凝膠4FF顆粒的活化

取10,mL凝膠顆?；旌弦?，在砂芯漏斗中用雙蒸水抽濾清洗、抽干．然后，將洗凈抽干的凝膠顆粒加入250,mL錐形瓶中，依次加15,mL DMSO、15,mL BDGE、0.42,g NaOH，用石蠟封口膜封口．再將上述懸浮液置于40,℃恒溫振蕩器中，200,r/min反應(yīng)6,h；反應(yīng)完畢，將反應(yīng)物倒于砂芯漏斗中，用體積分?jǐn)?shù)為20%,乙醇抽濾洗滌未反應(yīng)完全的殘留試劑，再用雙蒸水抽濾清洗至無環(huán)氧基檢出，得到經(jīng)活化的瓊脂糖凝膠4FF顆粒．

1.2.2 活化的瓊脂糖凝膠4FF顆粒與GSH的偶聯(lián)

將洗凈抽干活化后的瓊脂糖凝膠4FF顆粒置于硅化過的250,mL錐形瓶中，加入30,mL混合液(0.1,mol/L GSH，0.1,mol/L Na3PO4，1,mmol/L EDTA，pH 6.5)，用石蠟封口膜封口，置于37,℃恒溫振蕩器，180,r/min反應(yīng)24,h后，將反應(yīng)物用雙蒸水抽濾洗滌，用真空泵抽干得到凝膠顆粒．

1.2.3 終止偶聯(lián)反應(yīng)

向洗凈抽干的凝膠顆粒中加入30,mL反應(yīng)終止液(0.2,mol/L NaHCO3，0.5,mol/L NaCl，1,mmol/L EDTA，2,mol/L乙醇胺，pH 10.0)，然后置于25,℃恒溫振蕩器中，180,r/min反應(yīng)24,h，以終止未反應(yīng)的基團(tuán)；反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物用雙蒸水抽濾洗滌，用真空泵抽干后得GSH層析介質(zhì)．最后將該層析介質(zhì)于室溫下浸泡在體積分?jǐn)?shù)為20%,乙醇溶液中保存?zhèn)溆?

1.2.4 環(huán)氧基修飾密度的定量分析

瓊脂糖凝膠的環(huán)氧基修飾密度的測定采用硫代硫酸鈉滴定法[9]．準(zhǔn)確稱取0.5,g抽干活化后的凝膠顆粒置于50,mL錐形瓶中，并加入3,mL 1.3,mol/L硫代硫酸鈉和2滴酚酞指示劑；錐形瓶用石蠟封口膜封口后于37,℃、180,r/min反應(yīng)30,min；反應(yīng)后的溶液用0.01,mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至溶液由紅色變?yōu)闊o色，0.5,min內(nèi)保持不變?yōu)橹梗涗洺跏己偷味ńK止時0.01,mol/L鹽酸溶液體積V0和V1．按照式(1)計算瓊脂糖凝膠的環(huán)氧基修飾密度．

式中：S為環(huán)氧基修飾密度，mol/L；cHCl為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V0為鹽酸的初始體積，mL；V1為滴定后鹽酸的剩余體積，mL；m為活化介質(zhì)的質(zhì)量，g；ρ 為介質(zhì)密度，取1.02,g/mL．

1.2.5 GST蛋白、GST融合蛋白菌液的制備

具有GST標(biāo)簽的質(zhì)粒pGEX-6P-1的宿主菌大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，經(jīng)LB培養(yǎng)基37,℃培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)等過程，獲得表達(dá)有GST蛋白的工程菌．經(jīng)高壓破菌、高速離心后得到含GST蛋白的上清液，一部分上清液經(jīng)0.45,μm微孔濾膜抽濾，4,℃保存?zhèn)溆?；另一部分上清液?jīng)GE介質(zhì)純化，得到GST標(biāo)簽蛋白，–80,℃凍存?zhèn)溆茫瓽ST-Bcl-2、GST-Ald、GST-PTPN12菌液的獲得采用上述同一方法，并標(biāo)記為樣1、樣2、樣3．

1.2.6 谷胱甘肽親和層析介質(zhì)的層析性能評價

(1)穩(wěn)定性層析實(shí)驗(yàn)方法[10]：穩(wěn)定性分析樣品使用0.45,μm微孔濾膜抽濾過的含GST蛋白上清菌液．結(jié)合緩沖液為PBS，洗雜緩沖液為高鹽PBS(900,mL PBS，100,mL 5,mol/L NaCl，加雙蒸水定容至1,000,mL，pH 8.0)，洗脫緩沖液為1×GSH．第1次為空白循環(huán)，以結(jié)合緩沖液替代測試樣品上樣．第2～7次操作為平衡層析柱、上樣、結(jié)合緩沖液沖洗、洗雜緩沖液沖洗、洗脫緩沖液洗脫、洗雜緩沖液沖洗、雙蒸水沖洗．重復(fù)6次，上樣與洗脫的流量均為1,mL/min．

取2,mL自制層析介質(zhì)和GE層析介質(zhì)，分別置于兩支12,mL親和層析柱空柱中，分別取10,mL 6,mol/L鹽酸胍溶液置于量層析柱中，室溫放置1,h，最后用雙蒸水、結(jié)合緩沖液充分清洗．

(2)動態(tài)載量(mg/mL)的測定方法[11]：動態(tài)載量分析樣品0.45,μm微孔濾膜抽濾過的含GST蛋白上清菌液，1,mL自制GSH Sepharose 4,Fast Flow．結(jié)合緩沖液為PBS溶液，洗脫緩沖液為1×GSH (2.6,mmol/L GSH，3.13 mmol/L Tris，pH 8.0)溶液．

層析過程：采用?KTA HPLC蛋白純化系統(tǒng)，通道1條件下，以0.5,mL/min連續(xù)上樣，并使用收集器收集穿透液，待280,nm下吸光度(A280)升高并穩(wěn)定，此時目標(biāo)蛋白充滿全部管路，UV檢測值穩(wěn)定，程序由通道1改為通道2，自制GSH親和層析介質(zhì)接入管路，以0.5,mL/min繼續(xù)上樣．隨著上樣體積的增加，逐漸達(dá)到柱子的載量，可以在穿透樣中檢測到GST蛋白UV值，至穿透曲線中目標(biāo)樣品活性達(dá)到10%,0ρ時上樣完畢，以1,mL/min流量用1×GSH洗脫層析介質(zhì)上結(jié)合的GST目標(biāo)蛋白．計算Q10%,B，即得到在一定流量、一定緩沖液條件下的動態(tài)載量，按式(2)計算．

式中：Q10%,B為目標(biāo)樣品活性達(dá)到10%0ρ的動態(tài)載量，mg/mL；0ρ為樣品中目標(biāo)蛋白的質(zhì)量濃度，mg/mL；VA為通道2條件下穿透曲線中目標(biāo)樣品活性達(dá)到10%0ρ時上樣的總體積，mL；VC為總的柱床體積，mL．

(3)靜態(tài)最大載量(有效載量mg/mL)的測定方法：取GSH介質(zhì)0.1,mL置于1.5,mL EP管中，用1,mL PBS(140,mmol/L NaCl，2.7,mmol/L KCl，10,mmol/L Na2HPO4，1.8,mmol/L KH2PO4，pH 8.0)溶液潤洗5～10次，充分平衡，離心去除緩沖液；依次加入500,μL PBS溶液、500,μL GST蛋白(用前測定其準(zhǔn)確濃度，3次取均值0ρ)，加入的溶液總體積(V)為1,mL，37,℃結(jié)合30,min．4,000,r/min離心5,min，取上清液12,000,r/min離心5,min，測上清液質(zhì)量濃度(mg/mL)為1ρ(3次取平均值)．按式(3)計算GST載量．

(4)GST蛋白及融合蛋白純化方法：取2,mL自制層析介質(zhì)和GE層析介質(zhì)，分別置于兩支12,mL親和層析柱空柱中，依次用雙蒸水、結(jié)合緩沖液清洗，將等體積的樣品1溶液分別流經(jīng)兩支親和層析柱，然后用洗雜緩沖液潤洗層析柱，流出的液滴經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250檢測不變藍(lán)時停止?jié)櫹?，取介質(zhì)，制樣．樣品2、3制樣方法同上；樣品3流經(jīng)層析柱，洗雜緩沖液沖洗制樣后，加入適量的Prescission Protease，過夜酶切，洗脫目的蛋白，取樣，制樣．

(5)蛋白質(zhì)分析方法：SDS-PAGE電泳法，制板采用Laemmli體系，即12%,的分離膠和5%,的濃縮膠；蛋白質(zhì)濃度分析采用考馬斯亮藍(lán)法．

2 結(jié)果與討論

2.1 瓊脂糖凝膠活化條件的優(yōu)化

關(guān)于GSH層析介質(zhì)的制備條件已多見報道，本文結(jié)合金華雄等[7]方法進(jìn)行優(yōu)化探索，V基質(zhì)∶VDMSO∶VBDGE∶VNaOH＝1∶1.5∶1.5∶1.5，NaOH溶液濃度為0.6,mol/L，30,℃活化8,h．

2.1.1 無水反應(yīng)體系對瓊脂糖凝膠4FF活化的影響

在通常的水相體系中，反應(yīng)體系存在明顯的相界面，制約了活化反應(yīng)的速率．將反應(yīng)液中的0.6,mol/L NaOH水溶液換成等量NaOH固體，使瓊脂糖凝膠的活化反應(yīng)環(huán)境處于無水環(huán)境中，無水體系消除了反應(yīng)液的相界面，有效地提高了活化反應(yīng)的速率，環(huán)氧基修飾密度比加入相同濃度NaOH水溶液提高約2倍，結(jié)果如圖1所示．由圖1可以看出：在2～8,h內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，瓊脂糖凝膠顆粒的環(huán)氧基修飾密度不斷升高；其中反應(yīng)相同時間后，對NaOH固體的無水活化體系和NaOH水溶液的含水反應(yīng)體系分別測定瓊脂糖凝膠的環(huán)氧基修飾密度，發(fā)現(xiàn)每個時間點(diǎn)的環(huán)氧基修飾密度，無水反應(yīng)體系約為含水反應(yīng)體系的2倍，由此確定等量的NaOH固體的加入有利于瓊脂糖凝膠的活化，為后續(xù)優(yōu)化活化反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)．

圖1 不同反應(yīng)體系對環(huán)氧基修飾密度的影響Fig.1 Effect of different reaction systems on the densityof epoxy

2.1.2 溫度對瓊脂糖凝膠4FF活化的影響

BDGE活化溫度條件比較溫和，在一定范圍內(nèi)溫度升高，能夠促進(jìn)活化，但溫度超過一定值后，活化受到制約，環(huán)氧基修飾密度很難進(jìn)一步提升．10,mL基質(zhì)中加入15,mL BDGE、15,mL DMSO、0.36,g NaOH后，在不同溫度下活化8,h，結(jié)果如圖2所示．由圖2可以看出：活化溫度低于40,℃的情況下，隨著溫度的升高環(huán)氧基修飾密度提高；但溫度超過40,℃后，反應(yīng)液變黏稠，顏色變深，且環(huán)氧基修飾密度降低．由此可得最適反應(yīng)溫度為40,℃．

圖2 活化溫度對環(huán)氧基修飾密度的影響Fig.2 Effect of activation temperature on epoxy density

2.1.3 NaOH濃度對瓊脂糖凝膠4FF活化的影響

瓊脂糖介質(zhì)可在1.0,mol/L的NaOH溶液中穩(wěn)定存在2,h以上[11]．因此，活化反應(yīng)的NaOH濃度不會對介質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利的影響．在活化過程中，NaOH濃度的增加有利于提高瓊脂糖凝膠上環(huán)氧基的修飾密度，但是隨著NaOH濃度增加，環(huán)氧基團(tuán)會通過加劇水解作用而降低．10,mL基質(zhì)中加入15,mL BDGE、15,mL DMSO，活化溫度40,℃，在不同NaOH濃度下反應(yīng)8,h，結(jié)果如圖3所示．由圖3可知：隨著加入NaOH量增加，環(huán)氧基修飾密度逐漸變大，當(dāng)加入NaOH量超過0.42,g時，環(huán)氧基團(tuán)水解作用加劇，環(huán)氧基修飾密度開始降低．最終確定NaOH加入量為0.42,g．

圖3 NaOH濃度對環(huán)氧基修飾密度的影響Fig.3 Effect of NaOH concentration on epoxy density

2.1.4 時間對瓊脂糖凝膠4FF活化的影響

瓊脂糖介質(zhì)的環(huán)氧基修飾密度隨著反應(yīng)時間的延長而增加，但時間也要嚴(yán)格控制．10,mL基質(zhì)中加入15,mL BDGE、15,mL DMSO、0.42,g NaOH，反應(yīng)溫度為40,℃，活化不同的時間，結(jié)果如圖4所示．由圖4可以看出：隨著時間的推移，環(huán)氧基修飾密度逐漸升高，反應(yīng)6,h時環(huán)氧基修飾密度達(dá)到最大；超過6,h后，瓊脂糖基質(zhì)上已經(jīng)活化好的環(huán)氧根逐步水解，反應(yīng)液中環(huán)氧基的修飾密度開始降低．為保證環(huán)氧基修飾密度達(dá)到最大值，確定活化反應(yīng)時間為6,h.

圖4 反應(yīng)時間對環(huán)氧基修飾密度的影響Fig.4 Effect of activation time on epoxy density

總之，較高的介質(zhì)活化程度對于GSH親和載量的提高尤為關(guān)鍵．為此，確定活化最佳條件：V基質(zhì)∶VBDGE∶VDMSO＝1∶1.5∶1.5，即10,mL基質(zhì)加入0.42,g NaOH、15,mL DMSO、15,mL BDGE；反應(yīng)溫度為40,℃；反應(yīng)時間為6,h．在此條件下，環(huán)氧基修飾密度為60～65,μmol/mL，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)[7]報道的15～18,μmol/mL．

2.2 GSH偶聯(lián)的優(yōu)化

GSH配基的偶聯(lián)對層析介質(zhì)的載量影響較大，GSH上的巰基很活潑，偶聯(lián)反應(yīng)能在溫和的條件下(37,℃)進(jìn)行，GSH的添加量只要比體系中環(huán)氧基總物質(zhì)的量超過1倍即可[7]．彭方等[12]報道活化后的偶聯(lián)GSH反應(yīng)液比例為V活化后的基質(zhì)∶V偶聯(lián)液＝1∶3．結(jié)合實(shí)驗(yàn)室已有的偶聯(lián)條件(0.1,mol/L GSH，0.1,mol/L Na3PO4，1,mmol/L EDTA，37,℃反應(yīng)24,h)，對偶聯(lián)溶液pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，并對不同pH下制得的介質(zhì)的載量進(jìn)行測定，結(jié)果如圖5所示．由圖5可知：同一批次活化的基質(zhì)，隨著偶聯(lián)溶液pH變化，載量受到一定程度的影響．pH 6.5時，載量最大，pH高于6.5后，載量逐漸降低，說明不同pH條件可能影響配基的偶聯(lián)，進(jìn)而影響載量的大?。裕顑?yōu)的偶聯(lián)溶液pH為6.5．

圖5 偶聯(lián)溶液的pH對GSH親和層析介質(zhì)載量的影響Fig.5 Effect of the pH of the coupling solution on the loading capacity of GSH affinity chromatographic adsoebent

2.3 GSH層析介質(zhì)性能

2.3.1 穩(wěn)定性測試

為了測試層析介質(zhì)重復(fù)使用后的穩(wěn)定性，通過?KTA explorer 10,S蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行穩(wěn)定性的測試，1次空白對照加6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示．由圖6(a)錯疊和圖6(b)重疊的峰型圖比較可以看出，在峰型圖上保持了一致．這一結(jié)果表明層析介質(zhì)有較好的穩(wěn)定性，可以重復(fù)使用．為證實(shí)自制層析介質(zhì)與GE介質(zhì)的穩(wěn)定性差異，參考GE公司Glutathlone Sephrose 4 Fast Flow的填料特性[13]，GE產(chǎn)品能在1,mol/L醋酸鹽或6,mol/L的鹽酸胍水溶液中室溫放置1,h．將等量的自制GSH層析介質(zhì)和GE產(chǎn)品置于6,mol/L鹽酸胍溶液中室溫放置1,h后，純化相同的蛋白，結(jié)果如圖7所示．由圖7可以看出：等體積的GST菌液分別經(jīng)2,mL的自制層析介質(zhì)純化，得到SDS-PAGE，處理過后的自制GST親和層析介質(zhì)與GE介質(zhì)仍能純化蛋白．由此可以表明自制層析介質(zhì)具有較好的穩(wěn)定性．

圖6 GSH親和層析介質(zhì)層析峰形圖Fig.6 Peak shape of GSH affinity chromatographic adsoebent

圖7 兩種GSH親和層析介質(zhì)經(jīng)6,mol/L鹽酸胍水溶液室溫處理1,h層析穩(wěn)定性比較Fig.7 Comparison of chromatographic stability of two kinds of GSH affinity chromatographic adsoebents in 6 mol/L guanidine-hydrochloride solution for 1 h at room temperature

2.3.2 載量測試

(1)動態(tài)載量：為了測定已制備層析介質(zhì)的動態(tài)載量與商業(yè)GE介質(zhì)的動態(tài)載量，本實(shí)驗(yàn)使用?KTA HPLC蛋白純化系統(tǒng)對動態(tài)載量進(jìn)行了測定，見圖8．在一定流量、一定緩沖液條件下的動態(tài)載量，根據(jù)峰形圖，通道1時上樣體積5,mL時管路中充滿蛋白液，通道1改為通道2層析柱接入管路，穿透液達(dá)到目標(biāo)蛋白含量10%,時，記錄上樣體積VA，以及此時穿透液的蛋白質(zhì)量濃度．如圖8，通道2條件下，自制1,mL層析介質(zhì)穿透液達(dá)到目標(biāo)蛋白含量10%,時，總上樣體積VA為10,mL，0ρ為1.25,mg/mL．計算Q10%,B為12.5,mg/mL．根據(jù)GSH系列產(chǎn)品說明書，1,mL GSTrap FF column在0.5,mL/min上樣速率、1,mL/min流量下，洗脫13.9,mg/mL的目的蛋白，即動態(tài)載量為13.9,mg/mL[14]．排除自制1,mL GSH層析柱裝柱過程中的不可控因素，所以自制層析介質(zhì)的動態(tài)載量接近于GE介質(zhì)．

圖8 自制1,mL GSH介質(zhì)層析流動載量峰形圖Fig.8 The dynamic combination of the load of 1,mLGSH affinity chromatography

(2)靜態(tài)載量：將1,mL自制和GE層析介質(zhì)，用GST標(biāo)簽蛋白在室溫下進(jìn)行靜態(tài)載量的測試，結(jié)果見表1．自制介質(zhì)的載量測定值(14.19±0.98)mg/mL略高于GE介質(zhì)的載量測定值(13.59±0.80)mg/mL.參照GE公司的GSH系列產(chǎn)品說明書中Glutathlone Sephrose 4,Fast Flow填料在小于3,mL/min流量下，與GST蛋白結(jié)合載量約等于或大于10,mg/mL，排除實(shí)驗(yàn)中不可控因素，自制GSH層析介質(zhì)載量等同于或略高于GE介質(zhì)．

(3)SDS-PAGE結(jié)果(圖9)更好地證實(shí)了自制介質(zhì)與GE介質(zhì)載量差異．相同體積的GST融合蛋白上清樣1(GST-Bcl-2)、上清樣2(GST-Ald)、上清樣3(GST-PTPN12)分別流經(jīng)等體積的自制和GE層析介質(zhì)，分別取等體積的介質(zhì)樣，SDS-PAGE顯示，自制介質(zhì)結(jié)合的融合蛋白量略高于GE介質(zhì)，證明其載量略高于GE介質(zhì)．

2.3.3 與GE介質(zhì)層析效果對比

如圖10所示，相同體積GST-Bcl-2融合蛋白菌液分別流經(jīng)GE和自制GSH親和層析柱，經(jīng)菌液掛柱、雜蛋白洗脫、融合蛋白過夜酶切、目的蛋白洗脫等純化步驟以及純化結(jié)束后層析介質(zhì)的處理，SDS-PAGE顯示自制介質(zhì)純化效果較優(yōu)于GE介質(zhì)，處理后的介質(zhì)上無蛋白殘留，無非特異性吸附，已制備的層析介質(zhì)純化效果佳．

表1 比較兩種GSH層析介質(zhì)載量Tab.1 Comparison of the loading capacity of two kinds of GSH affinity chromatographic adsoebents

圖9 兩種親和層析介質(zhì)載量的SDS-PAGEFig.9 SDS-PAGE detection of the loading capacity of two kinds of GSH affinity chromatographic adsoebents

圖10 兩種親和層析介質(zhì)純化效果的SDS-PAGEFig.10 SDS-PAGE detection of the purification effect of two kinds of GSH affinity chromatographic adsoebents

3 結(jié) 語

本文在瓊脂糖的活化過程中以BDGE為連接臂，活化過程中加入NaOH固體從而使反應(yīng)體系為無水環(huán)境，結(jié)果顯示瓊脂糖凝膠介質(zhì)上環(huán)氧基的修飾密度顯著提高；同時在無水反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，對活化過程中的溫度、時間、NaOH濃度以及偶聯(lián)GSH反應(yīng)溶液的pH等進(jìn)行了單因子條件摸索，最終得到了較優(yōu)的活化條件，使得環(huán)氧基密度達(dá)到60～65,μmol/mL；根據(jù)制備的層析介質(zhì)最高載量下對應(yīng)的偶聯(lián)反應(yīng)液條件，得出偶聯(lián)溶液的最佳pH．最終探索得到GSH親和層析介質(zhì)制備的方法．利用GST標(biāo)簽蛋白進(jìn)行穩(wěn)定性及載量的測試，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下對商業(yè)GE介質(zhì)的參數(shù)進(jìn)行對比，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)該GSH親和層析介質(zhì)穩(wěn)定性能好，動靜態(tài)載量方面等同于或略優(yōu)于GE介質(zhì)．對GST-Bcl-2融合蛋白的純化過程證實(shí)自制GSH親和層析介質(zhì)純化效果等同于或優(yōu)于GE介質(zhì)．

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責(zé)任編輯：郎婧

The Preparation of GSH Affinity Chromatographic Adsorbent and the Research of its Chromatographic Characteristics

YI Qiufen1,2，ZHANG Cuiying1，JIANG Yongji1,2，TANG Zhaona1,2，CHEN Wencheng1,2，ZHU Xianming1,2，LIU Junwei2，DONG Hui2
(1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin International Joint Academy of Biomedicine，Tianjin 300457，China)

The glutathione(GSH)affinity adsoebent was prepared with Sepharose 4,Fast Flow and 1，4-butanediol diglycidyl ether(BDGE)，and then coupled with GSH based on the activated agarose particles.The results showed that the activating and coupling optimization conditions were adding into 10,mL of Sepharose 4,Fast Flow 0.42 g of NaOH，15,mL of dimethyl sulfoxide(DMSO) and 15,mL of BDGE.The incubation was at 40,℃ for 6,h．The activated agarosed particles were coupled with GSH,at 37,℃ for 24 h.The pH of the coupling reaction solution was 6.5.Under these conditions，the density of the epoxy group of the agarosed particles was 60-65 μmol/mL and the loading capacity was optimized to be (14.19±0.98) mg/mL.The adsorbents were used to purify the gultathione S transferase(GST)，the recombinant GST-Bcl-2，GST-Ald and GST-PTPN12 proteins.The result shows that the GSH affinity adsorbent has good purification effect and a high loading capacity，and its good stability in performance can make the adsorbent be used repeatedly.

GSH affinity chromatography；activation；density of epoxy group；loading capacity

Q81

A

1672-6510(2015)05-0007-08

10.13364/j.issn.1672-6510.20140143

2014-11-04；

2015-02-03

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目(31300601)

易秋分（1989—），女，湖北荊州人，碩士研究生；通信作者：董 輝，副研究員，donghui@irm-cams.ac.cn.