徐 星，肖 華，黃琳琳，別松濤

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，工業(yè)酶國家工程實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

黑曲霉胞外β–葡萄糖苷酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究

徐 星，肖 華，黃琳琳，別松濤

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，工業(yè)酶國家工程實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

利用硫酸銨鹽析、Superdex 200凝膠柱層析等步驟，從黑曲霉發(fā)酵液中純化得到兩種β–葡萄糖苷酶蛋白，其相對分子質(zhì)量分別為1.15×105和7.0×104左右，比活力分別為62.1,U/mg(相對分子質(zhì)量約為1.15×105)和53.0,U/mg(相對分子質(zhì)量約為7.0×104)，純化倍數(shù)分別為1.54和1.31，回收率分別為19.6%,和19.1%，β–葡萄糖苷酶最適水解pH為4.6，最適反應(yīng)溫度為50～55,℃．在pH 4.2～4.8、溫度40～60,℃下均能保持穩(wěn)定．Mn2+、Mg2+和K+對β–葡萄糖苷酶有不同程度的激活作用，而Ca2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+和Fe2+會抑制β–葡萄糖苷酶的酶活，Na+和Ba2+對β–葡萄糖苷酶活力影響不明顯．以pNPG為底物時，該酶的Km和vmax分別為2.33,mmol/L與3.14,mmol/(L·min)．

β–葡萄糖苷酶；分離純化；黑曲霉

β–葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21)，屬于水解酶類，又稱β–D–葡萄糖苷水解酶、龍膽二糖酶、纖維二糖酶和苦杏仁苷酶，最早被Liebig等[1]于1837年首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)．作為纖維素分解酶系中重要組成之一，它能催化糖基原子團與水解芳香基或烴基之間的糖苷鍵，釋放β–D–葡萄糖與相應(yīng)的配基，屬于纖維素酶類[2]．

延齡草苷(Trillin)，是中藥中的一個有效成分，對大多數(shù)植物病原真菌均有廣譜高效的抑菌作用，具有作為農(nóng)用殺菌劑的潛在開發(fā)價值[3]，可以作為合成具有生物活性的薯蕷類皂苷的前體物質(zhì)．但是，現(xiàn)在很難采用分離提取的方法從中藥材中大量獲得延齡草苷，主要利用化學(xué)合成的方法進行制備[4]．

目前，通過酶法制備延齡草苷的報道并不多見．本研究主要從黑曲霉CICC2475 中分離出β–葡萄糖苷酶，并對該酶的酶學(xué)性質(zhì)進行研究，為該酶催化薯蕷皂苷水解生成延齡草苷提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 微生物菌株與培養(yǎng)基

黑曲霉(Aspergillus niger)CICC2475斜面保藏培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，于4,℃下保藏．產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：麩皮20，(NH4)2SO41.5，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.01，F(xiàn)eSO40.01，121,℃濕熱滅菌20,min．

1.2 培養(yǎng)方法與粗酶液的制備

采用搖瓶發(fā)酵法，取活化好的黑曲霉的斜面，用山梨醇溶液洗下孢子，并以107,mL-1接種量接種于50,mL/250,mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28,℃、180,r/min，振蕩培養(yǎng)4～5,d．發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過濾，10,000,r/min離心，上清液即為β–葡萄糖苷酶粗酶液．

1.3 β–葡萄糖苷酶的分離與純化

向粗酶液中邊攪動邊緩慢加入一定飽和度的硫酸銨鹽析，4,℃條件下靜置過夜．10,000,r/min離心10,min，收集蛋白沉淀．上述粗蛋白用0.02,mol/L、pH 4.8的醋酸–醋酸鈉緩沖溶液溶解，放入透析袋經(jīng)透析除鹽，用BaCl2檢驗是否除盡．離心收集上清液，并冷凍干燥成粉末．

將上述濃縮后的粗酶粉溶于醋酸–醋酸鈉緩沖液(pH 4.8，0.02,mol/L)，過0.22,μm水系膜，制成樣品．樣品上樣至經(jīng)0.02,mol/L、pH 4.8的醋酸–醋酸鈉緩沖液平衡好的Superdex 200層析柱，用平衡緩沖液洗脫，流量為1,mL/min，收集具有β–葡萄糖苷酶活力的組分，脫鹽濃縮，于4,℃保存，用于酶學(xué)性質(zhì)的研究．

1.4 測定方法

1.4.1 β–葡萄糖苷酶酶活力的測定

β–葡萄糖苷酶酶活力測定時以對硝基苯基–β–D–葡萄糖苷(pNPG)為底物，測定波長為400,nm．定義每分鐘單位體積內(nèi)催化生成1,μmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位[5]．

1.4.2 蛋白含量的測定

蛋白含量的測定采用Bradford法[6]．

1.4.3 酶蛋白純度及相對分子質(zhì)量的測定

酶蛋白純度及相對分子質(zhì)量的測定采用SDS–聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法[7]，5%,濃縮膠，10%,分離膠．

1.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.5.1 酶反應(yīng)最適pH

配制濃度為0.2,mol/L不同pH(4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6)的醋酸–醋酸鈉緩沖液，作為β–葡萄糖苷酶酶活測定中的催化反應(yīng)緩沖溶液，將反應(yīng)體系置于50,℃下水浴10,min，利用pNPG法測定β–葡萄糖苷酶酶活，確定反應(yīng)最適pH．

1.5.2 酶反應(yīng)最適溫度

采用pH為4.6的醋酸–醋酸鈉緩沖液作為酶活測定的緩沖溶液，分別在40、45、50、55、60,℃條件下測定酶活，根據(jù)其酶活力大小確定β–葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度．

1.5.3 酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性

將酶液置于不同pH的醋酸–醋酸鈉緩沖液中，在4,℃冰箱中保存12,h，然后將各酶液的反應(yīng)pH調(diào)整至4.6，在相同條件下測定各酶液的酶活．

將pH為4.6的酶液分別置于不同溫度下保溫12,h，在50,℃下利用pNPG法測定各樣品酶活．

1.5.4 金屬離子對β–葡萄糖苷酶的影響

在反應(yīng)體系中添加不同的金屬離子溶液，使金屬離子的終濃度分別達到10,mmol/L和50,mmol/L，50,℃下保溫后測定酶活，并以未添加金屬離子的反應(yīng)體系為對照．

1.5.5 酶催化動力學(xué)特征常數(shù)

測定以pNPG為底物的動力學(xué)參數(shù)．配制1～10,mmol/L的底物溶液，按1.4.1的方法測定β–葡萄糖苷酶的活性，初速度只測定前10,min內(nèi)的數(shù)據(jù)．以時間t(min)為橫坐標(biāo)，產(chǎn)物濃度c(mmol/L)為縱坐標(biāo)作曲線圖，其斜率即為反應(yīng)速率v(mmol/(L·min)).采用雙倒數(shù)作圖法作圖，計算Km和vmax．

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸銨鹽析最佳飽和度的確定

取β–葡萄糖苷酶粗酶液各50,mL，取飽和度為25%,～100%,(4,℃)的硫酸銨進行鹽析，分別測上清液和沉淀中β–葡萄糖苷酶酶活，并以未經(jīng)硫酸銨鹽析時粗酶液的酶活為對照，其相對酶活為100%,，結(jié)果如圖1所示．當(dāng)硫酸銨飽和度為0～35%,(4,℃)時，上清液的酶活與沉淀的酶活無明顯變化；當(dāng)飽和度在35%～80%,(4,℃)時，沉淀的酶活隨硫酸銨的飽和度增加而顯著增加，同時上清液的酶活則隨著硫酸銨飽和度的增加而降低，尤以在65%,～80%,(4,℃)時降低的最為明顯；當(dāng)硫酸銨飽和度達到80%,(4,℃)以上時，上清液和沉淀的酶活均無明顯變化，可認為此階段中沉淀出的蛋白大部分為雜蛋白或變形蛋白．故，可先用飽和度為35%,的硫酸銨鹽析出雜蛋白，再用80%,飽和度的硫酸銨將目的蛋白充分沉降．

圖1 黑曲霉CICC2475 的β-葡萄糖苷酶鹽析曲線Fig.1 Salting out curve of β-glucosidase from Aspergillus niger CICC2475

2.2 酶的純化

粗酶液經(jīng)過硫酸銨鹽析與透析除鹽后，上樣至Superdex 200凝膠層析柱．用0.02,mol/L、pH為4.8的醋酸–醋酸鈉緩沖液平衡，并用平衡緩沖液以1,mL/min的流量洗脫．開始出峰時，洗脫體積為218,mL，從此時開始收集洗脫液，每3,mL收集1管，檢測每管的β–葡萄糖苷酶酶活．

洗脫體積為218～230,mL和239～245,mL處的收集液有β–葡萄糖苷酶活性．分別合并218～224,mL、224～230,mL和239～245,mL處的收集液，3個組分經(jīng)過脫鹽濃縮后，進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示．圖2顯示兩條蛋白帶，相對分子質(zhì)量約為1.15×105和7.0×104．

圖2 純化酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.2 SDS-PAGE of purified β-glucosidase

各個分離純化步驟的數(shù)據(jù)見表1．黑曲霉CICC2475發(fā)酵液經(jīng)過純化后，比活力分別達62.1 U/mg(相對分子質(zhì)量約為1.15×105)和53.0,U/mg(相對分子質(zhì)量約為7.0×104)，純化倍數(shù)分別為1.54和1.31，回收率分別為19.6%,和19.1%,．

表1 黑曲霉CICC2475的β-葡萄糖苷酶的初步純化Tab.1 Purification of the β-glucosidase from Aspergillus niger CICC2475

2.3 酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 β-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

pH對β–葡萄糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響如圖3所示．

圖3 pH對β-葡萄糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on β-glucosidase activity and stability

該酶最適水解pH為4.6；在pH＝4.2～4.8范圍內(nèi)較穩(wěn)定，當(dāng)pH＞5.6時，酶的穩(wěn)定性下降．

2.3.2 β–葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

溫度對β–葡萄糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響如圖4所示．β–葡萄糖苷酶酶活在40～55,℃隨溫度升高而增高，并在55,℃下達到最高酶活20.4,U/mL；酶活在50～55,℃下變化平緩，幾乎保持不變；而在溫度低于50,℃和高于55,℃會呈明顯下降趨勢．其最適溫度為50～55,℃，與已知的大部分β–葡萄糖苷酶的最適溫度相符[8]．將酶液分別置于不同溫度下保溫12,h，然后在50,℃下利用pNPG法測定各樣品酶活．由圖4可知：黑曲霉CICC2475的β–葡萄糖苷酶在所測溫度(40～60,℃)下，均具有較好的穩(wěn)定性，與Mchale等[9]的研究結(jié)果相同．

圖4 溫度對β–葡萄糖苷酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on β-glucosidase activity and stability

2.3.3 金屬離子對β–葡萄糖苷酶的影響

在反應(yīng)體系中添加一定濃度的金屬離子溶液，使其終濃度分別達到10,mmol/L和50,mmol/L，50,℃水浴1,h后測定各組酶活，以未添加金屬離子的反應(yīng)體系中的酶活性定義為100%,，結(jié)果見表2．

表2 金屬離子對β–葡萄糖苷酶活性的影響Tab.2 Effects of metallic ions on the activity of β-glucosidase

由表2可知：Mg2+和Mn2+對β–葡萄糖苷酶活力有較強的激活作用，當(dāng)加入的Mg2+和Mn2+的濃度為50,mmol/L時，β–葡萄糖苷酶酶活分別為對照的129.4%,和135.4%,；K+對酶活力也有一定的激活作用．而Zn2+和Cu2+對β–葡萄糖苷酶活力有很強的抑制作用，當(dāng)兩種離子的濃度為50,mmo/L時，酶活力僅為對照的32.1%,和21.4%,；此外，F(xiàn)e3+、Ca2+和Fe2+對β–葡萄糖苷酶也有一定的抑制作用；Na+和Ba2+對β–葡萄糖苷酶活力影響不明顯．

在陳靜等[10]的研究中，Mn2+、Fe2+、Ag+、Zn2+和Co2+對來源于米曲霉giF-10的β–葡萄糖苷酶有不同程度的激活作用，F(xiàn)e3+、Cu2+對β–葡萄糖苷酶活力有抑制作用．謝宇等[11]報道來源于曲霉No.5.1的β–葡萄糖苷酶，K+、Na+、Mg2+和Zn2+對其有激活作用，而Ag+和Fe2+對其具有明顯的抑制作用．來自黑曲霉NL-1的β–葡萄糖苷酶，Ag+對該酶具有強的抑制作用，其他金屬離子對酶活力影響不大[12]．劉德海等[13]對傘枝犁頭霉菌D8所產(chǎn)β–葡萄糖苷酶的研究結(jié)果顯示，K+、Mg2+、Ca2+和Fe2+對該酶具有一定的激活作用，而Cu2+則對β–葡萄糖苷酶活力有一定的抑制作用．

2.3.4 酶催化動力學(xué)特征常數(shù)

根據(jù)1.5.5的方法，測得不同濃度的pNPG溶液在2、4、6、8、10,min下產(chǎn)物對硝基苯酚pNP的濃度．以反應(yīng)時間t為橫坐標(biāo)，以產(chǎn)物濃度為縱坐標(biāo)作圖，得到以10、5、2、1,mmol/L pNPG為底物的反應(yīng)速率，分別記為v10、v5、v2和v1．以底物濃度的倒數(shù)為x軸坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)為y軸坐標(biāo)，采用Lineweaver-Burk作圖法作圖，結(jié)果見圖5．由圖5得到的公式計算出x軸與y軸上截距分別為－0.455和0.276，即1/Km與1/vmax的值分別是0.455與0.276．所以，以pNPG為底物的黑曲霉CICC2745分泌的β–葡萄糖苷酶的米氏常數(shù)Km為2.33,mmol/L，最大反應(yīng)速率vmax為3.14,mmol/(L·min)．

圖5 以pNPG為底物的β–葡萄糖苷酶Lineweaver-Burk圖Fig.5 Lineweaver-Burk chart of β-glucosidase using pNPG as the substrate

3 結(jié) 論

利用硫酸銨鹽析法和凝膠柱層析法，從黑曲霉CICC2475發(fā)酵液中分離純化得到兩個β–葡萄糖苷酶蛋白，其相對分子質(zhì)量分別為1.15×105和7.0× 104左右．該酶最適水解pH為4.6；最適反應(yīng)溫度為50～55,℃．在pH＝4.2～4.8、溫度40～60,℃下均能保持穩(wěn)定．Mn2+、Mg2+和K+對β–葡萄糖苷酶有不同程度的激活作用，而Ca2+、Fe3+、Zn2+、Cu2+和Fe2+抑制β–葡萄糖苷酶的酶活，Na+和Ba2+對β–葡萄糖苷酶活力影響不明顯．以pNPG為底物時，該酶的Km和vmax分別為2.33,mmol/L與3.14,mmol/(L·min).經(jīng)分離純化后的β–葡萄糖苷酶，可用于水解薯蕷皂苷生成延齡草苷，為酶法制備延齡草苷提供新的方法.

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責(zé)任編輯：周建軍

Purification of β-glucosidase from Aspergillus niger and its Enzymological Character

XU Xing，XIAO Hua，HUANG Linlin，BIE Songtao
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Two kinds of beta-glucosidase protein were separated and purified from Aspergillus niger through ammonium sulfate precipitation and Superdex 200,gel filtration chromatography.The enzyme molecular weights were about 1.15×105and 7.0×104，which were identified by SDS-PAGE.The specific activifies were 62.1 U/mg and 53.0 U/mg.And then they were purified to 1.54-fold and 1.31-fold with a recovery of 19.6%, and 19.1%,.The optimum reaction pH and temperature for beta-glucosidase were 4.6,and 50-55,℃.The enzyme is stable in the pH value range of 4.2-4.8 and at the temperature between 40,℃ to 60,℃.Mn2+，Mg2+and K+have different degree of activation to the beta-glucosidase，while Ca2+，F(xiàn)e3+，Zn2+，Cu2+and Fe2+can inhibit the activity of the beta-glucosidase.Na+and Ba2+have no obvious effect on the activity.The Kmand vmaxvalues of the enzyme are 2.33 mmol/L and 3.14 mmol/(L·min) respectively.

beta-glucosidase；purification；Aspergillus niger

Q814.1

A

1672-6510(2015)05-0015-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20140081

2014–05–21；

2014–12–28

徐 星（1987—），女，河南鄭州人，碩士研究生；通信作者：別松濤，副教授，biesongtao@tust.edu.cu.