任利平，汪建明

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

發(fā)酵酶解法制備干腌火腿風(fēng)味基料過程中酶解條件的優(yōu)化

任利平，汪建明

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

采用酶解和發(fā)酵相結(jié)合的方法制備干腌火腿風(fēng)味基料，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析對(duì)其酶解條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到適宜的酶解條件為：蛋白酶添加量1%，脂肪酶添加量0.75%，酶解時(shí)間2.5,h，酶解溫度45,℃；經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的綜合評(píng)分為17.99，感官評(píng)分41.8，氨基態(tài)氮含量為2.25%，游離脂肪酸含量為1.99%．后酶解液使用植物乳桿菌和釀酒酵母在一定條件下發(fā)酵，經(jīng)過氧化制得了風(fēng)味評(píng)分較高的干腌火腿風(fēng)味基料．

中性蛋白酶；中性脂肪酶；干腌火腿；風(fēng)味基料；發(fā)酵；酶解

干腌火腿獨(dú)特的風(fēng)味是由內(nèi)源酶、外源酶和微生物的共同作用在火腿中產(chǎn)生了大量的游離脂肪酸、游離氨基酸[1]及一些微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，經(jīng)過復(fù)雜的變化而形成．酶解法具有水解率高、條件溫和、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失較少、條件易于控制、得到的產(chǎn)品風(fēng)味較好等優(yōu)勢(shì)而受到人們青睞，利用酶解液制備食品原料具有廣闊的前景[2–3]．作為目前生產(chǎn)肉味香精的關(guān)鍵技術(shù)，酶解技術(shù)是通過水解動(dòng)植物蛋白制備肉味香精的前提物質(zhì)[4–6]．然而，單純的酶解工藝得到的產(chǎn)物不僅風(fēng)味單薄而且不能避免一些苦味肽的產(chǎn)生，從而影響產(chǎn)品風(fēng)味[7]，但酶解產(chǎn)物經(jīng)過發(fā)酵可以得到濃厚的風(fēng)味．乳酸菌和酵母菌因?yàn)榫哂休^好的耐鹽性并具有較多的生理功能而常常作為肉品發(fā)酵劑使用[8]，在發(fā)酵火腿和發(fā)酵香腸的制作中使用較為廣泛[9–10]，尤其是混菌發(fā)酵的風(fēng)味與口感比單一菌種發(fā)酵更好[11].本研究對(duì)發(fā)酵酶解法制備金華火腿風(fēng)味基料過程中的酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料與設(shè)備

新鮮豬后腿肉肉糜購于天津人人樂超市．

中性蛋白酶、中性脂肪酶，DSM公司；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)由天津科技大學(xué)菌種保藏室提供．

數(shù)顯pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津天宇機(jī)電有限公司；分析天平，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；電熱恒溫水浴鍋，北京儀器設(shè)備廠；WFZ75型紫外–可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司．

1.2 工藝流程

肉糜→腌制(4,℃腌制48,h)→酶解→滅酶→接種發(fā)酵→滅菌→干腌火腿風(fēng)味料．

1.3 蛋白酶和脂肪酶的耐鹽與耐亞硝酸鹽效果的測(cè)定

耐鹽性：分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,、4%,、6%,、8%,、10%,的食鹽溶液，分別保持蛋白酶和脂肪酶的溫度為最適溫度條件下測(cè)定兩種酶的酶活．

耐亞硝酸鹽性：分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05‰、0.10‰、0.15‰、0.20‰、0.25‰的NaNO2溶液，分別保持蛋白酶和脂肪酶的溫度為最適溫度條件下測(cè)定兩種酶的酶活．

1.4 酶解條件的優(yōu)化

1.4.1 蛋白酶和脂肪酶添加量的確定

蛋白酶和脂肪酶添加量分為兩組進(jìn)行測(cè)定，每組稱取5份經(jīng)過預(yù)處理的樣品25,g置于250,mL三角瓶中，分別加入脂肪酶0.75%,，45,℃酶解3,h．第1組蛋白酶添加量分別為0.5%,、1.0%,、1.5%,、2.0%,、2.5%,，第2組其他條件不變，脂肪酶添加量分別為0.25%,、0.50%,、0.75%,、1.00%,、1.25%,．

1.4.2 酶解時(shí)間的確定

酶解時(shí)間分為兩組進(jìn)行測(cè)定，每組稱取5份經(jīng)過預(yù)處理的樣品25,g置于250,mL三角瓶中，添加最佳添加量的脂肪酶和蛋白酶，酶解溫度為45,℃，酶解時(shí)間分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0,h．

1.4.3 酶解溫度的確定

酶解溫度分為兩組進(jìn)行測(cè)定，每組稱取5份經(jīng)過預(yù)處理的樣品25,g置于250,mL三角瓶中，添加最佳添加量的脂肪酶和蛋白酶，酶解溫度分別為35、40、45、50、55,℃，酶解時(shí)間為最佳酶解時(shí)間．

1.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并對(duì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，確定最佳酶解條件，并在最佳酶解條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)．

1.5 感官評(píng)價(jià)方法

選擇10名事先經(jīng)過培訓(xùn)的食品專業(yè)研究生作為感官評(píng)價(jià)員進(jìn)行產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)，具體評(píng)價(jià)內(nèi)容從氣味和滋味兩個(gè)方面進(jìn)行，酶解液的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1．

表1 酶解液感官評(píng)價(jià)表Tab.1 Sensory evaluation of enzymatic hydrolysate

1.6 理化指標(biāo)的測(cè)定

脂肪酶酶活的測(cè)定參考文獻(xiàn)[12]，蛋白酶酶活和氨基態(tài)氮分別采用福林試劑法[13]和甲醛電位滴定法[14]進(jìn)行測(cè)定，游離脂肪酸含量和蛋白質(zhì)含量分別參照GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[15]和GB/T 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)·食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[16]的方法測(cè)定，脂肪含量采用索氏提取法[17]進(jìn)行測(cè)定．

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶和脂肪酶的耐鹽性和耐亞硝酸鹽性

腌制作為常用的食品保藏方法常用于肉類和蔬菜的保藏中，但是食鹽和亞硝酸鹽的存在會(huì)對(duì)酶活產(chǎn)生相應(yīng)的影響．因此，首先對(duì)酶制劑的耐鹽性和耐亞硝酸鹽性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1和圖2所示．

圖1 蛋白酶和脂肪酶的耐鹽性Fig.1 Salt tolerance of neutral protease and neutral lipase

圖2 蛋白酶和脂肪酶的耐亞硝酸鹽性Fig.2 Nitrite tolerance of neutral protease and neutral lipase

由圖1可知：蛋白酶和脂肪酶的活力隨著食鹽含量的增加都呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，這與已有研究[18]結(jié)論一致．在食鹽含量為6%,時(shí)酶活最高，因此，從防腐和對(duì)人體健康的影響及酶活三方面考慮，選擇食鹽含量為6%,進(jìn)行腌制．由圖2可知，亞硝酸鹽含量對(duì)脂肪酶和蛋白酶活的影響呈不規(guī)律的變化，因此，按照亞硝酸鹽含量的限量標(biāo)準(zhǔn)，選擇0.15‰亞硝酸鹽含量進(jìn)行腌制．

2.2 酶解條件的優(yōu)化

2.2.1 蛋白酶和脂肪酶添加量對(duì)雙酶水解的影響

蛋白酶和脂肪酶添加量對(duì)雙酶水解的影響如圖3、圖4所示．由圖3可知：?jiǎn)为?dú)加入蛋白酶時(shí)，酶解產(chǎn)物的含量低于雙酶同時(shí)加入時(shí)酶解產(chǎn)物的含量，這可能是由于脂肪酶的存在水解了包裹在蛋白質(zhì)周圍及其他部分的脂肪，使蛋白酶更容易與底物蛋白質(zhì)接觸，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水解．隨著蛋白酶添加量的增加氨基態(tài)氮含量呈增加趨勢(shì)，到蛋白酶添加量為2%,后增加緩慢，結(jié)合感官評(píng)價(jià)與水解程度，蛋白酶添加量選取1.5%,．由圖4可知，雙酶同時(shí)添加的水解產(chǎn)物含量低于單獨(dú)加入脂肪酶時(shí)的含量，這可能是由于蛋白酶水解了部分脂肪酶所致．結(jié)合感官評(píng)價(jià)結(jié)果，脂肪酶添加量選取0.75%,．

圖3 蛋白酶添加量對(duì)雙酶水解的影響Fig.3 Influence of additive amount on enzymolysis protease content on hydrolysis

圖4 脂肪酶添加量對(duì)雙酶水解的影響Fig.4 Influence of lipase additive amount on enzymolysis

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)雙酶水解的影響

酶解時(shí)間對(duì)雙酶水解的影響如圖5所示．隨著酶解時(shí)間的增加，水解產(chǎn)物的含量逐漸增加，而當(dāng)酶解時(shí)間超過3.5 h后，酶解的速度明顯減慢，這可能是隨著底物的分解，底物濃度逐漸降低造成的．在酶解時(shí)間為3 h時(shí)獲得較高的感官評(píng)價(jià)結(jié)果，綜合考慮，酶解時(shí)間選擇3 h．

圖5 酶解時(shí)間對(duì)雙酶水解的影響Fig.5 Influence of time on enzymolysis

2.2.3 酶解溫度對(duì)雙酶水解的影響

酶解溫度對(duì)雙酶水解的影響如圖6所示．由圖6可知，在小于45,℃范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高酶解產(chǎn)物的含量增加，這可能是由于在45,℃時(shí)達(dá)到了或者最接近酶的最適溫度，因而水解速度較快．結(jié)合感官評(píng)價(jià)結(jié)果，選擇45,℃作為最佳酶解溫度．

圖6 酶解溫度對(duì)雙酶水解的影響Fig.6 Influence of temperature on enzymolysis

2.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)酶解條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2．

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.2 Box-Behnken factor level table

使用發(fā)酵酶解法制備干腌火腿風(fēng)味基料，首先利用蛋白酶和脂肪酶酶解分別產(chǎn)生游離氨基酸和游離脂肪酸，經(jīng)過植物乳桿菌和釀酒酵母混合發(fā)酵后再經(jīng)過氧化發(fā)生復(fù)雜的變化，從而產(chǎn)生干腌火腿的風(fēng)味．因此，首先對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表3．Y1、Y2、Y3、Y分別表示感官評(píng)價(jià)(分)、游離氨基酸含量(%,)、游離脂肪酸含量(%,)和綜合評(píng)價(jià)(分)．

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Tab.3 Result of RSM design experiment

由回歸方程方差分析(表4)可以看出：模型的F檢驗(yàn)結(jié)果P＝0.000,5＜0.01，表明模型極顯著；失擬項(xiàng)P＝0.441,6＞0.05，不顯著；模型的決定系數(shù)R2＝0.869,8，校正決定系數(shù)Adj.R2＝0.739,5．這說明該模型具有良好的擬合度和較小的實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，該實(shí)驗(yàn)可以用于對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析及對(duì)理論數(shù)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)．

表4 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Tab.4 Analysis of variance for regression model

由表4可知，酶解時(shí)間和酶解溫度為極顯著影響因素，另外脂肪酶含量為顯著影響因素．蛋白酶對(duì)綜合指標(biāo)無顯著影響．

響應(yīng)面圖如圖7—圖12所示．由圖7和圖8可以看出，隨著脂肪酶和蛋白酶及酶解時(shí)間的增加，綜合指標(biāo)呈先增大后減小的趨勢(shì)，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，蛋白酶添加量為1%,，脂肪酶添加量為0.75%,，最佳酶解時(shí)間為2.5 h得到了較高的感官評(píng)分．由圖9—圖12可知，在酶解時(shí)間、酶解溫度、酶添加量在一定范圍內(nèi)變化時(shí)均呈現(xiàn)出綜合指標(biāo)先增大后減小的趨勢(shì)，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致．通過軟件Box-Behnken求解回歸方程，得到最佳酶解條件為：蛋白酶添加量1%,，脂肪酶添加量0.75%,，酶解時(shí)間2.5 h，酶解溫度45,℃；經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到綜合評(píng)分17.99與測(cè)值18.19相近，此時(shí)，感官評(píng)分41.8，氨基態(tài)氮含量為2.25%,，游離脂肪酸含量為1.99%,．

圖7 脂肪酶添加量和蛋白酶添加量的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of lipase and protease content

圖8 脂肪酶添加量和酶解時(shí)間響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of lipase content and enzyme disgestion time

圖9 脂肪酶添加量和酶解溫度響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface of lipase content and enzymolysis temperature

圖10 蛋白酶添加量和酶解時(shí)間響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface of protease content and enzyme disgestion time

圖11 蛋白酶添加量和酶解溫度響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface of enzymolysis temperature and protease additive content

圖12 酶解溫度和酶解時(shí)間響應(yīng)面圖Fig.12 Response surface of enzymolysis temperature and enzyme disgestion time

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳酶解條件為：蛋白酶添加量1%,，脂肪酶添加量0.75%,，酶解時(shí)間2.5 h，酶解溫度45,℃；經(jīng)過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到綜合評(píng)分17.99，感官評(píng)分41.8，氨基態(tài)氮含量為2.25%,，游離脂肪酸含量為1.99%,．得到的酶解液進(jìn)行發(fā)酵得到了風(fēng)味較好的干腌火腿風(fēng)味基料，補(bǔ)充了單純發(fā)酵、酶解的不足，為以后風(fēng)味料制備工藝的發(fā)展提供了理論依據(jù)．

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責(zé)任編輯：郎婧

Optimizing the Preparation Process of Dry-cured Ham Flavor Base Though Fermentation Combined with Enzymolysis

REN Liping，WANG Jianming
(College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Enzymolysis and fermentation were used to prepare the dry-cured ham flavor base.Single factor experiments were used to get the best conditions of each factor.Then the process was optimized through Response Surface Experiment and the best enzymolysis conditions were obtained with 1% protease and 0.75% lipase，at 45,℃ temperature.The colligation score of the verification test,was 17.99，sensory score 41.8，amino nitrogen content 2.25%，and free fatty acid 1.99%.The product was fermented by Lactobacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae in proper conditions，and then an ideal flavor base of dry-cured ham was got through oxidation.

neutral protease；neutral lipase；dry-cured ham；flavor base；fermentation；enzymolysis

TS251

A

1672-6510(2015)05-0026-06

10.13364/j.issn.1672-6510.20140141

2014-11-03；

2015-04-13

任利平（1989—），女，河南開封人，碩士研究生；通信作者：汪建明，教授，wangjianming@tust.edu.cn.