席 波,宋東輝,孫 晶,劉鳳路,邸富榮
(天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457)
十種微藻粗多糖的抑菌作用及海水小球藻粗多糖的抗氧化活性
席 波,宋東輝,孫 晶,劉鳳路,邸富榮
(天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,天津 300457)
采用濾紙擴(kuò)散法研究10種微藻粗多糖對(duì)細(xì)菌和真菌的抑菌作用,對(duì)抑菌作用明顯的微藻粗多糖提取物,進(jìn)一步研究其抗氧化活性.結(jié)果表明:10種微藻粗多糖提取物中,海水小球藻(Marine chlorella vulgaris)的粗多糖提取物抑菌能力最好,其粗多糖提取物對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)、藤黃八疊球菌(Micrococcus luteus)、假絲酵母(Monilia albican)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌圈直徑分別達(dá)13.0、8.0、11.0、10.0,mm.進(jìn)一步研究其抗氧化活性,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力最高為61.2%,,超氧陰離子清除能力最高達(dá)到74.47%,,羥基自由基清除能力最大為75.37%,,抗脂質(zhì)過氧化能力最高達(dá)74.32%,.
微藻;粗多糖;抑菌;抗氧化
微藻多糖是由多個(gè)相同或不同的單糖基通過糖苷鍵相連形成的高分子碳水化合物.作為一種廣泛存在于微藻體內(nèi)的天然大分子物質(zhì),微藻多糖除了具有傳統(tǒng)的工業(yè)價(jià)值外,近年來的研究表明,它們還具有多種生物活性及藥用功能,如增強(qiáng)機(jī)體免疫活性、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗輻射等作用[1];還有其他研究表明微藻多糖是通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能發(fā)揮這些作用的[2].微藻多糖可以通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖與分化、刺激巨噬細(xì)胞的吞噬功能、促進(jìn)細(xì)胞因子和抗體的產(chǎn)生等途徑來實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)[3].藻類多糖物質(zhì)具有多種生物活性,而抗氧化研究大多集中在大型海藻中,對(duì)微藻多糖抗菌和抗氧化研究開展的較少.
本研究對(duì)10種微藻粗多糖進(jìn)行了抑菌活性檢測(cè),對(duì)抑菌作用明顯的微藻粗多糖提取物進(jìn)一步研究其抗氧化活性,包括粗多糖對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力、抗脂質(zhì)過氧化能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子去除能力以及還原力的分析測(cè)定,旨在篩選出抗氧化活性強(qiáng)的微藻,為研制新型免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù).
1.1 材料
1.1.1 微藻
本實(shí)驗(yàn)選取8種淡水微藻及2種海水微藻.其中淡水微藻為集胞藻6803(Synechocystis sp.PCC6803)、發(fā)菜念珠藻(Nostoc flagelliformis)、聚球藻7942(Synechococcus sp.PCC7942)、魚腥藻7120 (Anabaena sp.PCC7120)、普通念珠藻(Nostoc commune)、四尾柵藻(Scenedesmus quadricanda)、銅綠微囊藻905(Microcystis aeruginosa FACHB905)及普通小球藻(Chlorella vulgaris);海水微藻為杜氏鹽藻(Dunaliella salina)和海水小球藻(Marine chlorella vulgaris).以上微藻均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)(FACHB-collection),由天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院微生物制品實(shí)驗(yàn)室持續(xù)繼代保種.
1.1.2 試劑
Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4·7H2O、濃硫酸、鄰二氮菲、C6H5OH、FeSO4·7H2O、H2O2、DPPH(1,1–二苯基–2–三硝基苯肼)、Tris、鄰苯三酚、新鮮雞蛋PBS卵黃混濁液、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、鐵氰化鉀、FeCl3、維生素B12、檸檬酸、檸檬酸鐵銨.
1.1.3 供試菌種
革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(Escherichia coli);革蘭氏陽(yáng)性菌:藤黃八疊球菌(Micrococcus luteus)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);真菌:假絲酵母(Monilia albican).以上菌株均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC),由天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院微生物制品實(shí)驗(yàn)室持續(xù)繼代保種.1.1.4 培養(yǎng)基
BG-11培養(yǎng)基、f/2培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[4–7]進(jìn)行配制.
1.2 方法
1.2.1 微藻的培養(yǎng)
普通小球藻、發(fā)菜念珠藻、集胞藻6803、四尾柵藻、普通念珠藻、聚球藻7942、銅綠微囊藻905和魚腥藻7120均采用BG-11培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng).杜氏鹽藻和海水小球藻采用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng).恒溫?fù)u床培養(yǎng)條件為:光照度3,000,lx,光/暗周期12,h/12,h,培養(yǎng)溫度25~30,℃,轉(zhuǎn)速150,r/min.
1.2.2 粗多糖提取及得率測(cè)定[8–11]
微藻培養(yǎng)10,d后,離心收集藻細(xì)胞,采用冷凍干燥法制備成藻粉.干藻粉稱質(zhì)量(m1),加入提取介質(zhì)后超聲破碎(功率為700,W、輻射時(shí)間為10,s、間隔時(shí)間10,s),于80,℃水浴提取6,h.離心取上清液,濃縮到適當(dāng)體積,加3.8倍體積的95%,無水乙醇,醇沉過夜.離心收集沉淀,復(fù)溶于適量蒸餾水中,調(diào)pH至7,加0.5%,中性蛋白酶,50,℃保溫3,h,離心去沉淀.再用Sevage法去除蛋白[12],其中氯仿與正丁醇體積比為5∶1,劇烈振蕩0.5,h,離心去除有機(jī)層,得到水相層,重復(fù)3次.蒸餾水透析2,d,期間4~5,h換1次水,透析液離心除去不溶物后減壓濃縮,濃縮后冷凍干燥得到粗多糖(m2).根據(jù)式(1)計(jì)算粗多糖得率.
1.2.3 粗多糖抑菌實(shí)驗(yàn)[13]
培養(yǎng)皿倒入15~20,mL培養(yǎng)基,待凝固后吸取菌懸液0.5,mL于對(duì)應(yīng)培養(yǎng)皿中,涂布均勻,將粗多糖溶液配制成相同質(zhì)量濃度(25,mg/mL)的溶液,將已滅菌的圓形濾紙片分別浸入粗多糖溶液和無菌蒸餾水中用鑷子夾出,將已風(fēng)干的帶有提取物的圓形濾紙片置于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中,每個(gè)培養(yǎng)基放置3個(gè)帶有提取物的圓形濾紙片和1個(gè)帶有無菌蒸餾水的圓形濾紙片,密封后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48~72,h并觀察其抑菌效果.
1.2.4 抗氧化活性測(cè)定
半數(shù)有效濃度(median effect concentration,EC50)指清除率50%,時(shí)的多糖樣品濃度,是用來評(píng)價(jià)微生物多糖抗氧化活性的一個(gè)重要參數(shù),EC50值越低,表明該組分的抗氧化能力越強(qiáng)[14].EC50值的計(jì)算分析通過SPSS statistics19 軟件完成.
(1)DPPH自由基清除能力測(cè)定[15]:用無水乙醇溶解4,mg DPPH并定容于100,mL容量瓶中,避光保存(0~4,℃).取不同體積(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mL)的樣品溶液加雙蒸水定容至1,mL,與4,mL DPPH溶液加入同一試管中,搖勻,在黑暗中放置30,min,以無水乙醇作為空白,在517,nm下測(cè)定其吸光度(A).以BHT為陽(yáng)性對(duì)照,按照式(2)計(jì)算清除率,清除率越大抗氧化能力越強(qiáng).
式中:A0為1,mL無水乙醇加4.0,mL DPPH 溶液的吸光度;A1為待測(cè)液加4.0,mL DPPH 溶液的吸光度.
(2)抗脂質(zhì)過氧化能力測(cè)定[16]:用0.1,mol/L、pH 7.45的磷酸鹽緩沖液(PBS)配制卵黃懸液,其中卵黃與PBS體積比為 1∶25,吸取卵黃懸液0.4,mL,在試管中分別加入不同體積(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mL)的被測(cè)溶液并加水定容到1.0,mL;再加入0.4,mL的FeSO4(25,mmol/L)和0.1,mol/L pH 7.45 的PBS 2.2,mL,37,℃氣浴恒溫振蕩器中振蕩15,min,取出后加入20%, 的三氯乙酸1.0,mL靜置10,min,4,500,r/min離心10,min;吸取4,mL上清液加入0.8%,的硫代巴比妥酸2,mL,加塞,放入沸水浴中15,min,冷卻后,以空白管(6,mL PBS代替),調(diào)零,532,nm處測(cè)定吸光度.以BHT為陽(yáng)性對(duì)照,樣品抗氧化活性用對(duì)卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制率按照式(3)計(jì)算.
式中:A0為不加樣品管的吸光度;A為樣品管的吸光度.
(3)羥基自由基清除能力測(cè)定[15,17]:在6只試管中分別加入PBS(pH 7.4)0.4,mL、雙蒸水0.25,mL、5,mmol/L的鄰二氮菲溶液0.15,mL和7.5,mmol/L FeSO40.5,mL后立即混勻.測(cè)試管中分別加不同體積(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mL)的多糖溶液,用水補(bǔ)齊到1.0,mL,最后加入1%,的H2O20.1,mL,37,℃水浴保溫60,min.在536,nm處測(cè)定吸光度,以BHT為陽(yáng)性對(duì)照,損傷管中加入1%,的H2O2而不加樣品,對(duì)照管中兩者都不加,空白管中加樣品而不加1%的H2O2.按照式(4)計(jì)算清除率.
式中:A樣品、A損傷、A對(duì)照和A空白分別為樣品管、損傷管、對(duì)照管和空白管在536,nm處的吸光度.
(4)超氧陰離子去除能力測(cè)定[15,17]:在試管中分別加入不同體積(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mL)的多糖溶液,用水補(bǔ)齊至1.0,mL,然后加入0.05,mol/L的Tris–鹽酸緩沖(pH 8.2)3.0,mL,25,℃水浴保溫10,min,再分別加入12,μL同樣預(yù)溫的30,mmol/L的鄰苯三酚,混勻并精確反應(yīng)4.0,min,0.5,mL濃鹽酸終止反應(yīng),紫外分光光度計(jì)在320,nm下測(cè)定反應(yīng)溶液的吸光度,以本實(shí)驗(yàn)中的Tris–鹽酸緩沖液作空白,以BHT為陽(yáng)性對(duì)照,按照式(5)計(jì)算清除率.
式中:A空白為Tris-鹽酸緩沖液的吸光度;A對(duì)照為反應(yīng)體系(Tris–鹽酸+鄰苯三酚)的吸光度;A樣品為反應(yīng)體系加入樣品后的吸光度.
(5)還原力測(cè)定[17]:在試管中分別加入不同體積(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,mL)的待測(cè)溶液加水定容至1.0,mL.加入0.2,mol/L、pH 6.6的PBS 2.5,mL和1%,鐵氰化鉀2.5,mL,50,℃水浴保溫20,min,然后加入10%,三氯乙酸2.5,mL,3,000,r/min離心.吸取上清液2.5,mL,加入雙蒸水2.5,mL和0.1%, 的FeCl3溶液0.5,mL,在700,nm處測(cè)定吸光度,以BHT為陽(yáng)性對(duì)照.
2.1 微藻粗多糖的得率
10種微藻粗多糖得率的測(cè)定結(jié)果見表1.其中銅綠微囊藻905粗多糖得率最低,為1.2%,;普通念珠藻最高,達(dá)4.9%,.
表1 供試微藻粗多糖的得率測(cè)定Tab.1Extraction yield of the crude polysaccharides from 10,microalgae
2.2 不同微藻的多糖粗提物抑菌活性
10種微藻粗多糖對(duì)4種測(cè)試菌株表現(xiàn)出不同程度的抑制作用(表2).海水小球藻和魚腥藻7120均對(duì)4種指示菌有較好的抑制作用,其中海水小球藻粗多糖抑菌效果明顯優(yōu)于本實(shí)驗(yàn)中其他微藻多糖.海水小球藻粗多糖對(duì)大腸桿菌抑制作用最強(qiáng),抑菌圈直徑為13.0,mm,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為10.0,mm;而杜氏鹽藻粗多糖對(duì)藤黃八疊球菌的抑菌效果最強(qiáng),其抑菌圈直徑為10.5,mm.其余微藻的抑菌效果不一,其中普通念珠藻和海水小球藻粗多糖表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌藤黃八疊球菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用;海水小球藻多糖對(duì)大腸桿菌和假絲酵母有一定的抑制作用;發(fā)菜念珠藻和聚球藻7942多糖只對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用;銅綠微囊藻905粗多糖只對(duì)真菌假絲酵母有抑制作用;四尾柵藻粗多糖對(duì)大腸桿菌、藤黃八疊球菌和金黃色葡萄球菌都有抑制作用.
表2 微藻多糖的抑菌圈直徑Tab.2 Antibacterial circle diameters of microalgae polysaccharides
本實(shí)驗(yàn)選取的10種微藻中,除銅綠微囊藻905外,其他9種微藻粗多糖均對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制作用,說明上述粗多糖提取物對(duì)革蘭氏陰性菌有較好的抑制作用;杜氏鹽藻、集胞藻6803、魚腥藻7120和銅綠微囊藻905粗多糖均對(duì)藤黃八疊球菌有抑制作用;普通小球藻、普通念珠藻、魚腥藻7120、銅綠微囊藻905、四尾柵藻和海水小球藻粗多糖均對(duì)真菌假絲酵母有抑制作用;發(fā)菜念珠藻、聚球藻7942、普通念珠藻、魚腥藻7120、四尾柵藻和海水小球藻對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用.其中海水小球藻粗多糖提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和真菌均有明顯抑制作用.
錢卓權(quán)等[18]研究發(fā)現(xiàn),羊棲菜、鼠尾藻和海帶等大型海藻提取物對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大分別為3.4,mm和6.3,mm.而本研究的發(fā)菜念珠藻、普通念珠藻和海水小球藻等對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均在7.5,mm以上,分析可能微藻多糖含量高并有對(duì)抑菌起關(guān)鍵作用的官能團(tuán),也可能是因?yàn)樘崛〈侄嗵堑臏囟?、pH等因素不同,使得不同方法的多糖提取純度有差異造成的.
2.3 微藻粗多糖的抗氧化活性
綜合考慮供試微藻多糖得率和抑菌效果,并鑒于海水小球藻多糖活性的極少研究,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)只對(duì)海水小球藻粗多糖進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定.
2.3.1 海水小球藻粗多糖對(duì)DPPH自由基清除效果
DPPH自由基被廣泛用于評(píng)價(jià)物質(zhì)的抗氧化能力.海水小球藻粗多糖提取物對(duì)DPPH自由基存在清除效果(圖1).在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),它們隨著質(zhì)量濃度的增加對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增加,當(dāng)粗多糖質(zhì)量濃度小于2,mg/mL,其清除DPPH自由基的效果尤為明顯,海水小球藻粗多糖和BHT的EC50分別為3.498,mg/mL和1.219,mg/mL.表明海水小球藻粗多糖清除DPPH 自由基的能力較強(qiáng).
圖1 海水小球藻粗多糖在不同質(zhì)量濃度下清除DPPH自由基能力Fig.1 Scavenging rate of Chlorella polysaccharide on DPPH free radicals at different concentrations
2.3.2 海水小球藻粗多糖抗脂質(zhì)過氧化效果
機(jī)體產(chǎn)生的自由基對(duì)機(jī)體造成損傷的一個(gè)重要的途徑就是脂質(zhì)過氧化,因此脂質(zhì)過氧化程度也是檢測(cè)抗氧化能力的重要指標(biāo).海水小球藻粗多糖在不同濃度下抗脂質(zhì)過氧化能力如圖2所示.
圖2 海水小球藻粗多糖在不同濃度下抗脂質(zhì)過氧化能力Fig.2 Anti-lipid peroxidation of Chlorella polysaccharide at different concentrations
在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著海水小球藻多糖質(zhì)量濃度的增加,其抗脂質(zhì)過氧化能力增強(qiáng),抑制率最高達(dá)到74.32%,,多糖質(zhì)量濃度在0~1.6,mg/mL時(shí),其抗脂質(zhì)過氧化能力提高迅速.當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到3.2,mg/mL后,其抗脂質(zhì)過氧化能力提高不明顯并趨于穩(wěn)定.海水小球藻粗多糖EC50為0.915,mg/mL (<1,mg/mL),表明其抗脂質(zhì)過氧化能力非常高.
2.3.3 海水小球藻粗多糖對(duì)羥基自由基清除效果
在眾多活性氧自由基中,羥自由基可致生物大分子如某些蛋白質(zhì)、核酸、不飽和脂肪酸等嚴(yán)重?fù)p傷.因此羥自由基清除率也是檢測(cè)抗氧化活性的一個(gè)重要參數(shù).海水小球藻粗多糖在不同濃度下清除羥基自由基能力如圖3所示.小球藻粗多糖在0~1.6,mg/mL時(shí)清除羥基自由基的能力明顯提高,達(dá)到3.2,mg/mL后清除能力基本不變,清除率最大為75.37%,.其EC50值達(dá)到1.122,mg/mL,表明海水小球藻粗多糖清除羥基自由基能力較好.
圖3 海水小球藻粗多糖在不同濃度下清除羥基自由基能力Fig.3 Scavenging rate of Chlorella polysaccharide on hydroxyl radicals at different concentrations
2.3.4 海水小球藻粗多糖對(duì)超氧陰離子清除效果
超氧陰離子自由基是一種相對(duì)較弱的氧化劑,可間接引發(fā)脂質(zhì)過氧化,因此常用清除超氧陰離子自由基的能力來反應(yīng)抗氧化活性.由圖4可知,海水小球藻粗多糖表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除超氧陰離子能力,而且隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng).粗多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.6,mg/mL時(shí),其清除率達(dá)到最高值74.47%,.海水小球藻粗多糖EC50達(dá)0.467,mg/mL,表明其清除超氧陰離子的能力非常強(qiáng).
圖4 海水小球藻粗多糖在不同濃度下清除超氧陰離子能力Fig.4 Scavenging rate of Chlorella polysaccharide on superoxide anion radicals at different concentrations
2.3.5 海水小球藻粗多糖還原力效果
抗氧化劑的還原力與其抗氧化性活性有十分密切的關(guān)系,因此可通過測(cè)定還原力來說明抗氧化活性的大?。蓤D5可知,海水小球藻粗多糖還原力呈質(zhì)量濃度依賴性,即隨著多糖質(zhì)量濃度的升高,其還原力呈增強(qiáng)趨勢(shì).
圖5 小球藻粗多糖在不同濃度下的還原力Fig.5 Chlorella polysaccharide reducing power at different concentrations
有研究表明[19–20]多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)因素有關(guān),如糖單元的類型和糖苷鍵的構(gòu)型、多糖的取代基、多糖的空間結(jié)構(gòu)、多糖的相對(duì)分子質(zhì)量大小等都能影響其活性.而多糖抗氧化活性的強(qiáng)弱不是單一因素所致,是與多糖的相對(duì)分子質(zhì)量、單糖組成、構(gòu)型和糖苷鍵連接方式等結(jié)構(gòu)特征的多方面因素有關(guān),這也是影響多糖抗氧化活性差異的主要因素.本研究由于實(shí)驗(yàn)條件所限,只研究了粗多糖的抑菌活性及體外抗氧化活性.下一步將開展海水小球藻多糖的純化及體內(nèi)外抗氧化活性研究,預(yù)計(jì)純化后的海水小球藻多糖將會(huì)有更好的抗氧化能力.
海水小球藻粗多糖對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)和革蘭氏陽(yáng)性菌(藤黃八疊球菌和金黃色葡萄球菌)以及真菌(假絲酵母)的抑菌效果較好,抑菌圈直徑分別為13.0、8.0、11.0、10.0,mm.
海水小球藻粗多糖抗氧化活性研究表明,在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),海水小球藻粗多糖對(duì)DPPH清除率最高為61.2%,,抗脂質(zhì)過氧化能力最高達(dá)74.32%,,羥基自由基清除率最大為75.37%,,超氧陰離子清除率最高達(dá)到74.47%,.隨著質(zhì)量濃度的增加,吸光度變大,還原力增強(qiáng).
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責(zé)任編輯:郎婧
Anti-microbial Activities of Crude Polysaccharide Extracts from Ten Species of Microalgae and the Antioxidant Activities of Crude Polysaccharide Extracts from Marine chlorella vulgaris
XI Bo,SONG Donghui,SUN Jing,LIU Fenglu,DI Furong
(Tianjin Key Laboratory of Marine Resources and Chemistry,College of Marine Science and Engineering,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)
This research studied the anti-microbial capacity of crude polysaccharide extracs from ten species of microalgae by using filter paper diffusion method,and the antioxidant activities of the optimized crude polysaccharide extracts were investigated.The results showed that the crude polysaccharide extracts from Marine chlorella vulgaris had more significant anti-microbial capacity and antioxidant activities than that of other microalgae.The inhibition zone of the crude polysaccharide against Escherichia coli,Micrococcus luteus,Monilia albican and Staphylococcus aureus were 13.0,mm,8.0,mm,11.0,mm and 10.0,mm,respectively.The antioxidant activities of the optimized crude polysaccharide extracts to eliminate DPPH free radical,superoxide anion radical,hydroxyl radical and anti-lipid peroxidation were up to 61.2%,,74.47%,, 75.37%, and 74.32%,,respectively.
microalgae;crude polysaccharide;anti-microbial capacity;antioxidant activities
Q949.6
A
1672-6510(2015)05-0020-06
10.13364/j.issn.1672-6510.20140140
2014-10-31;
2015-01-29
天津市海洋局科技興海資助項(xiàng)目(KJXH2013-16)
席 波(1990—),男,山西人,碩士研究生;通信作者:宋東輝,教授,dhsong@tust.edu.cn.