李 艷，董振玲，李 佳，牟德華,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018；3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800）

PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)羊羔美酒大曲中細(xì)菌多樣性

李 艷1,2，董振玲1,3，李 佳1，牟德華1,*

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018；3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800）

目的：使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gelelectrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)檢測(cè)羊羔美酒大曲中的細(xì)菌，探尋酒曲中細(xì)菌菌群的多樣性組成，研究羊羔美酒的風(fēng)味特征。方法：對(duì)羊羔美酒大曲進(jìn)行樣品處理、提取總DNA、PCR擴(kuò)增、DGGE條帶的切膠與測(cè)序分析。結(jié)果：利用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)到羊羔美酒大曲中包含魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌（Pediococcus）、芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）和4個(gè)不可培養(yǎng)的細(xì)菌種類。結(jié)論：羊羔美酒大曲中細(xì)菌菌群多樣性豐富，其中乳酸菌菌群是最大的細(xì)菌群系。

羊羔美酒大曲；細(xì)菌；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳

羊羔美酒是一種北方特色黃酒，其釀造所使用的酒曲是大曲。通常大曲的制作是以小麥為原料，經(jīng)破碎加水壓制成磚塊裝的曲坯，自然接種微生物，在適宜的品溫、濕度等條件下自然培育而成[1-3]。大曲是釀制大曲酒的生香劑、糖化劑與發(fā)酵劑，含有豐富的微生物與酶系，其質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)酒的品質(zhì)和風(fēng)味有極大的影響，故有“曲是酒之骨”之稱[4-6]。獨(dú)特的大曲微生物群系組成是影響酒類香氣物質(zhì)和種類繁多的風(fēng)味物質(zhì)的重要原因之一。羊羔美酒有著與眾不同的風(fēng)味與口感，與大曲中獨(dú)特的微生物群系緊密相關(guān)。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方式可以得到菌株的純培養(yǎng)物，利于后續(xù)研究菌株的特性及其在酒類釀造中的作用，但是常規(guī)培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件也會(huì)在微生物的分離研究中遺漏很多物種，況且大多數(shù)細(xì)菌很難培養(yǎng)或者不可培養(yǎng)。要想盡可能全面地了解羊羔美酒大曲中的細(xì)菌菌群的種類，應(yīng)當(dāng)尋求新的技術(shù)方法和手段。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denatured gradient gelelectrophoresis，PCRDGGE）技術(shù)的原理是根據(jù)堿基序列上存在差異的不同DNA在雙鏈進(jìn)行解鏈時(shí)需要的變性劑體積分?jǐn)?shù)不同，一旦DNA雙鏈解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將急劇下降。因此，將PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度相同的DNA片段加樣到含有變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，序列不同的DNA片段在其相應(yīng)的變性劑體積分?jǐn)?shù)條件下變性，發(fā)生解鏈行為，導(dǎo)致電泳速度的迅速下降，停留在與其相應(yīng)的變性劑梯度位置，染色后即可在凝膠上呈現(xiàn)分散的條帶。自1979年Fischer和Lerman提出后，該技術(shù)經(jīng)改進(jìn)與完善，已經(jīng)成為一項(xiàng)成熟穩(wěn)定的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)并得到廣泛應(yīng)用[7-8]。

本研究以羊羔美酒釀造用酒曲為原料，以細(xì)菌菌群為研究對(duì)象，在非培養(yǎng)的方式下利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)酒曲中細(xì)菌直接進(jìn)行分析檢測(cè)，為進(jìn)一步研究羊羔美酒的風(fēng)味物質(zhì)形成和優(yōu)化傳統(tǒng)發(fā)酵工藝提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與引物

羊羔美酒大曲 河北味道府酒業(yè)有限責(zé)任公司。

配制溶液的各種試劑和生化試劑等均為分析純，引物F341（5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’）、R534（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）、F341-GC（5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’）上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

PCR儀、凝膠成像分析儀、變性梯度凝膠電泳裝置美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-8C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一公司。

1.3方法

1.3.1樣品的處理

稱取3 g均勻的酒曲樣品，加27 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），200 r/min搖床30 min，旋渦振蕩5 min，4層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)200 r/min離心5 min，取上清液，將上清液8 000 r/min離心3 min，得到沉淀，加入5 mL PBS，旋渦振蕩5 min，離心沉淀，重復(fù)洗滌2次[9-11]。將樣品置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA提取方法的選擇

羊羔美酒大曲中總基因組DNA的提取，共選擇3種不同的方法：1）化學(xué)裂解法：取樣品重懸于TE溶液，用TE溶液洗滌一次，除去上清液。加20 mg/mL的溶菌酶50μL，于37℃水浴60 min。向每管加入200μL裂解緩沖液，混合均勻。加入10μL蛋白酶K（10 mg/mL），55℃處理0.5 h，向每管加入66μL飽和的NaCl溶液，充分混合后，12 000 r/min離心10 min，然后除去蛋白質(zhì)復(fù)合物及細(xì)胞壁等殘?jiān)?。離心后取上層清液，加入等體積的Tris飽和酚，14 000 r/min離心5 min，取上清液用等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）溶液抽提2次，取出上清液，用預(yù)冷的1倍體積的冰異丙醇沉淀DNA，15 000 r/min離心10 min，棄去上清液。用400μL70%的乙醇洗滌沉淀2次。真空干燥后，用50μLTE緩沖液（10 mmol Tris-HCl，1 mmol EDTA，pH 8.0）溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆茫?）CTAB法[12]；3）氯化芐法[13]。

DNA樣品用0.8 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Marker為λ-HindⅢ，電壓90 V，電泳時(shí)間60 min，拍照觀察。

1.3.3 PCR技術(shù)的選擇

1.3.3.1普通PCR

普通PCR反應(yīng)體系（在0.2 mL離心管內(nèi)配制50 ?L反應(yīng)體系）：10×buffer緩沖液5μL，dNTP 1μL，Taq酶（0.5 U/L）0.5μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 2μL，補(bǔ)足水至50μL。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性7 min，94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3.3.2降落PCR

降落PCR：反應(yīng)體系同普通PCR。

反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性7 min，94℃變性1 min，65℃退火1 min，每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，經(jīng)20個(gè)循環(huán)后，退火溫度降低至55℃，72℃延伸1 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min[14-15]。

PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：吸取5μLPCR產(chǎn)物，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，80 V電壓50 min，經(jīng)過(guò)EB染色15 min后，利用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.3.4 DGGE最佳實(shí)驗(yàn)條件的研究

設(shè)置實(shí)驗(yàn)變性劑體積分?jǐn)?shù)為45%～60%[16-17]，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)PCR產(chǎn)物加樣量為5、15、25、35、45μL，以尋求最佳PCR產(chǎn)物加樣量。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳PCR產(chǎn)物加樣量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)電泳時(shí)間為7、10、13、16 h，以尋求最佳電泳時(shí)間。

1.3.5條帶切膠回收、純化及測(cè)序

條帶的切膠回收：將DGGE電泳完畢的凝膠，置于凝膠成像儀上，選取目標(biāo)條帶，使用無(wú)菌手術(shù)刀切割后放入滅過(guò)菌的1.5 mL離心管中，加入50μL的滅菌去離子水清洗2次，加入50μL的滅菌去離子水并于4℃靜置過(guò)夜。

取過(guò)夜儲(chǔ)存樣品液1μL作為PCR反應(yīng)模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序與引物同1.3.3節(jié)。

目的條帶的純化：將上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行2次變性梯度凝膠電泳，重復(fù)切膠回收步驟，以使得目的條帶得到純化。直至目的條帶單一、無(wú)雜帶干擾為止。

目的條帶的測(cè)序：將純化完成的樣品進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，引物為F341（不帶GC夾子）與R534，反應(yīng)程序與體系同1.3.3節(jié)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)合格后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，進(jìn)行同源性分析。下載相關(guān)菌株序列信息，使用MEGA4軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)樹圖，并以Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行1 000次可信度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法的選擇

實(shí)驗(yàn)選擇3種不同的DNA提取方法，得到的DNA經(jīng)過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析后，電泳圖譜見圖1，羊羔美酒大曲中細(xì)菌總基因組DNA在23 kb左右；3種方法均可以對(duì)酒曲中細(xì)菌總DNA進(jìn)行有效提取，但是從DNA的得率與DNA完整性來(lái)說(shuō)，氯化芐法優(yōu)于化學(xué)裂解法和CTAB法。圖譜中泳道前部有少量拖尾現(xiàn)象，可能是樣品中存在少量DNA降解或者是存在少量的RNA。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，氯化芐方法提取的DNA完整性較好，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 DNA電泳圖Fig.1 DNA electrophoretogram

2.2 PCR技術(shù)的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用普通PCR技術(shù)與降落PCR技術(shù)兩種方法對(duì)酒曲中宏基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖檢測(cè)，結(jié)果見圖2。

圖2 不同PCR方法擴(kuò)增產(chǎn)物的圖譜Fig.2 Electrophoretogram of amplified products of the V3 region of 16S rDNA by different PCR techniques

由圖2可以看出，普通PCR技術(shù)與降落PCR技術(shù)都可以對(duì)酒曲樣品中總基因組DNA進(jìn)行有效擴(kuò)增，在200 bp處均有目的條帶。但是，普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶有彌散現(xiàn)象，略有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，而降落PCR技術(shù)條帶無(wú)這兩種現(xiàn)象，且降落PCR技術(shù)本身可以減少非特異擴(kuò)增，故本實(shí)驗(yàn)選擇降落PCR技術(shù)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3 DGGE最佳實(shí)驗(yàn)條件的研究

從圖3可以看出，PCR產(chǎn)物加樣量5～35μL條帶越來(lái)越清晰明了，電泳圖譜效果也越來(lái)越好，但是35～45μL圖譜的清晰度沒(méi)什么差別，而背景色卻越來(lái)越嚴(yán)重，綜合考慮，PCR產(chǎn)物加樣量確定為35μL，并以此進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

從圖4可以看出，電泳時(shí)間較短時(shí)，泳道前方的條帶分離度很差，區(qū)分效果不好，而泳道后半部分的條帶分離度與區(qū)分度較好；隨著電泳時(shí)間的延長(zhǎng)，泳道前方的條帶分離效果逐漸越來(lái)越好，但是后方的條帶卻逐漸在區(qū)分度上越來(lái)越差。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道，由于在變性梯度電泳過(guò)程中PCR產(chǎn)物有了GC夾子，可以在遇到最佳變性劑體積分?jǐn)?shù)時(shí)不完全解鏈，故此時(shí)不會(huì)繼續(xù)隨著電泳時(shí)間的延長(zhǎng)而繼續(xù)移動(dòng)，但從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，DNA序列解鏈后仍會(huì)繼續(xù)隨著電泳的進(jìn)行而移動(dòng)，只是移動(dòng)速率會(huì)大大降低。綜合考慮，電泳時(shí)間為13 h時(shí)，電泳效果最佳。

圖4 電泳時(shí)間的選擇Fig.4 Selection of electrophoresis time

2.4條帶切膠回收、純化及測(cè)序

圖5 條帶進(jìn)切膠圖Fig.5 Electrophoresis of DNA bands of interest

圖6 DGGE切膠條帶重新PCR電泳圖Fig.6 Electrophoresis of PCR-amplified products of target bands in DGGE profile

2.4.1條帶的切膠回收DGGE電泳完畢后，共選取了17個(gè)條帶進(jìn)行了切膠回收，結(jié)果見圖5。將切膠回收的條帶使用F341與R534進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖電泳分析，結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，除了條帶2與條帶4切膠回收失敗外，其他條帶均能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。條帶2、4失敗的原因可能是由于切膠回收產(chǎn)物的濃度太低，不能滿足PCR反應(yīng)要求。

2.4.2電泳條帶純化

圖7 切膠條帶的純化結(jié)果Fig.7 Electrophoresis of purified bands

經(jīng)過(guò)數(shù)次變性梯度凝膠純化后，回收條帶的DGGE圖譜（圖7）可以看出，使用DGGE凝膠可以對(duì)切膠條帶有很好的純化效果。

2.4.3測(cè)序

將純化后的條帶進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得基因序列結(jié)果登陸GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)，測(cè)序結(jié)果見表1。

通過(guò)鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以判斷細(xì)菌的同源關(guān)系，結(jié)果見圖8。在系統(tǒng)發(fā)育樹上同一分支的細(xì)菌同源關(guān)系最近，可以清楚地看出所分離細(xì)菌的分類情況及各自最相近的種屬名稱。

表1 條帶16S V3可變區(qū)序列分析Table 1 Sequence analysis of the bands based on 16S rDNA V3 region

圖8 基于16S V3區(qū)序列和Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8 Phylogenetic tree based on sequences of 16S rDNA V3 region and Neighbor-Jointing method

由圖8可以看出，所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rDNA序列的相似性在94%～100%之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，與條帶1、5、7、8、9同源性最高的物種分別對(duì)應(yīng)為Weissella hanii、Weissella paramesenteroides、Pediococcus pentosaceus、Lactobacillussp.、Lactobacillus namurensis，共涉及魏斯氏菌屬、乳桿菌屬和片球菌屬3個(gè)屬。乳酸菌對(duì)釀酒過(guò)程及最終產(chǎn)品的風(fēng)味形成有突出貢獻(xiàn)，發(fā)酵初期產(chǎn)生大量乳酸，使發(fā)酵環(huán)境的pH值下降，可抑制有害菌繁殖；發(fā)酵中后期產(chǎn)生的乳酸是形成乳酸乙酯和其他香氣成分的提前物質(zhì)，進(jìn)而對(duì)增強(qiáng)酒的甜醇感和延長(zhǎng)味感、增加酒的香氣柔和性等發(fā)揮作用[18]?？梢?，乳酸菌群系是羊羔美酒大曲中重要的產(chǎn)酸細(xì)菌菌群，推測(cè)其與羊羔美酒最終獨(dú)特的口感有一定相關(guān)性。條帶10、11、12、15同源性最高的物種分別對(duì)應(yīng)為unculturedBacilli bacterium、Bacillus thermolactis、Bacillussp.、unculturedBacillussp.，都屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌，趙佳[19]和李增勝[20]等研究表明，芽孢桿菌（如枯草芽孢桿菌）有水解淀粉、分解蛋白質(zhì)的能力，其在酒類釀造過(guò)程中起著增香、產(chǎn)酸、增加酒體綿甜與清香有一定作用，所以必要的芽孢桿菌對(duì)釀造過(guò)程是有益的。而與高溫放線菌屬有較高同源性的條帶為14、16、17，最相似序列為普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）序列，可見其也在酒曲細(xì)菌菌群中占有一席之地。有研究[21-23]表明在芝麻香型白酒大曲中曾分離到普通高溫放線菌，并發(fā)現(xiàn)其具有嗜高溫酶、堿性磷酸鹽酶、酯酶、類脂酯酶活性等特性，而對(duì)其在酒曲和釀酒過(guò)程中的作用，尚需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了利用PCR-DGGE技術(shù)快速高效分析羊羔美酒大曲中細(xì)菌菌群構(gòu)成的方法，并利用PCRDGGE技術(shù)分析了羊羔美酒大曲中細(xì)菌的多樣性。研究結(jié)果表明，在非培養(yǎng)方式下，檢測(cè)到羊羔美酒大曲中細(xì)菌物種資源信息非常豐富，從酒曲中直接進(jìn)行總基因組DNA的提取，得到的物種里包含了魏斯氏菌屬（Weissella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌（Pediococcus）、芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus）、葡萄球菌（S t a p h y l o c o c c u s）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces），除此之外，還發(fā)現(xiàn)了4個(gè)不可培養(yǎng)的微生物種類，分別為條帶6 uncultured bacterium、條帶10 unculturedBacilli bacterium、條帶13uncultured bacterium和條帶15 unculturedBacillussp.。由此可見，在羊羔美酒大曲中存在著部分不可培養(yǎng)的微生物。微生物的非培養(yǎng)鑒定技術(shù)結(jié)合PCR-DGGE分子生物學(xué)手段，非常有利于釀酒微生物資源的研究，尤其是對(duì)不可培養(yǎng)的物種。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了羊羔美酒大曲中微生物物種資源的信息，為進(jìn)一步研究具有我國(guó)北方特色的地方名酒風(fēng)味物質(zhì)特征、改進(jìn)傳統(tǒng)的配料和釀造工藝提供了可靠的參考依據(jù)。

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[23]束瑩.古井貢酒大曲中微生物群落結(jié)構(gòu)的鑒定及分析[D].哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2013.

Bacterial Diversity of Daqu for Yanggaomeijiu as Determined by PCR-Mediated DGGE

LI Yan1,2, DONG Zhenling1,3, LI Jia1, MOU Dehua1,*

(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China; 3. Hebei Inatural Biological Technology Co. Ltd., Shijiazhuang 050800, China)

Purpose: To detect and analyze the bacterial diversity of Yanggaomeijiu Daqu (traditional Chinese fermentation starter) by polymerase chain reaction-denatured gradient gelelectrophoresis (PCR-DGGE) for further understanding of the flavor characteristics of Yanggaomeijiu. Methods: Samples of Yanggaomeijiu were processed and then extracted to obtain total DNA for PCR amplification and the amplified DNA bands were excised from the gels for sequence analysis by DGGE. Results: By using PCR-DGGE, the genus ofWeissella,Lactobacillus,Pediococcus,Sporolactobacillus,Staphylococcus,Thermoactinomycesand 4 unculturablebacterial strains were identified in Yanggaomeijiu Daqu. Conclusions: This work shows that the bacterial diversity is abundant in Yanggaomeijiu Daqu among which, lactic acid bacteria constituted the largest group.

Yanggaomeijiu Daqu; bacteria; PCR-DGGE

TS261.1

A

1002-6630（2015）12-0142-06

10.7506/spkx1002-6630-201512027

2014-09-29

河北省石家莊市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（101171271A；10117901A）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2011208028）

李艷（1958—），女，教授，本科，研究方向?yàn)轱嬃暇漆勗?、釀酒微生物。E-mail：lymdh5885@163.com

*通信作者：牟德華（1960—），男，教授，本科，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：dh_mou@163.com