孫 濤 ，張洪峰，劉 璐(邯鄲市中心醫(yī)院藥劑科住院部藥房，河北 邯鄲 056001)

三黃瀉心湯出自醫(yī)圣張仲景的《金匱要略》，由黃連、黃芩和大黃組成［1］。功能主治為清熱瀉火解毒，化瘀涼血止血。用于火毒血熱所致的身熱煩躁、目赤口瘡、咽喉牙齦腫痛、大便秘結(jié)，以及咽炎、扁桃體、牙齦炎見上述證候者。本研究采用水和乙醇2 種提取工藝對該方抑菌活性進行比較，旨在為以其為方劑的中成藥生產(chǎn)工藝的改進及開發(fā)新藥提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥材飲片黃連(Coptis chinensis)、黃芩(Scutellaria baicalensis)和大黃(Rheum palmatum)均購于邯鄲醫(yī)藥大廈。

1.2 供試菌株

革蘭陰性菌為大腸埃希菌(Escherichia coil)，革蘭陽性菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，均由河北省邯鄲市中心醫(yī)院檢驗科保存。

1.3 培養(yǎng)基

LB 固體和液體培養(yǎng)基，配方:酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉(NaCl)10 g，水1 000 ml，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g，調(diào)節(jié)pH 值為7.2 ±0.1，121 ℃滅菌20 min。

1.4 儀器與試劑

DZF-6050 型真空干燥箱(梅特勒-托利多儀器公司)、FAB 型電子天平(上海精密儀器廠)、DXF-200 型粉碎機(長沙常宏制藥機械設(shè)備廠)、RE-52C 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海勒頓實業(yè)有限公司)、SHD 型循環(huán)水式多用真空泵(保定高新區(qū)陽光科教儀器廠)、ZWYR-211C 型搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)、SJ-CJ-2FDQ 型超凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)、HWS-050 恒溫恒濕培養(yǎng)箱(金壇市華城創(chuàng)威實驗儀器廠)、YX-400A 型電熱蒸汽滅菌器(上海三申醫(yī)療器械有限公司);75%乙醇(分析純，北京化工廠)等，水為純凈水。

1.5 供試藥品制備

將中藥材黃連、黃芩和大黃于25 ℃烘干，粉碎。三黃瀉心湯組方:黃連、黃芩、大黃按1∶1∶2比例組成。三黃瀉心湯組方分別用水和75%乙醇提取，黃連用75%乙醇提取，分別室溫提取3 次，合并各自全部提取液，減壓濃縮得到提取物，使每毫升提取液含黃連生藥材1 g。

1.6 測定抑菌活性

采用紙片擴散法，在無菌條件下，在直徑為6.0 mm 的圓形濾紙片上滴注6 μl 供試溶液，在超凈工作臺中吹干后將該濾紙片均勻擺放在涂有菌懸液的培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿中均勻擺放3 個紙片，分別為黃連乙醇提取液、三黃瀉心湯組方水提取液、三黃瀉心湯組方乙醇提取液，重復(fù)3 次，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)

取1 g/ml 藥液2.0 ml 加入滅菌液體培養(yǎng)基2.0 ml 中，藥液質(zhì)量濃度為0.5 g/ml，采用二倍體度稀釋法分別稀釋為0.250、0.125、0.625、0.313、0.157、0.078 g/ml。設(shè)空白對照(培養(yǎng)基)和生長對照(菌液、培養(yǎng)基)。加入0.1 ml 菌混懸液，培養(yǎng)24 h，無菌生長的最低質(zhì)量濃度即為MIC。采用十字交叉法測量抑菌直徑，記錄結(jié)果，直徑＜8 mm 者不進行統(tǒng)計。

1.8 測定三黃瀉心湯組方乙醇提取液穩(wěn)定性

三黃瀉心湯組方乙醇提取液經(jīng)365 nm 紫外光30、60、90、120 min 照射及60、80、100、120 ℃加熱處理，抑菌活性制定方法與“1.6”項相同。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，采用Duncan 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑菌活性結(jié)果及MIC 值

三黃瀉心湯組方水和乙醇提取物的抑菌活性均高于黃連藥材乙醇提取物，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);三黃瀉心湯組方乙醇提取物的抑菌活性強于水提取物，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。三黃瀉心湯組方水提取物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC 值分別為0.313、0.625，三黃瀉心湯組方乙醇提取物的MIC 值均為0.313。

表1 三黃瀉心湯組方水和乙醇提取物及黃連藥材乙醇提取物的抑菌效應(yīng)(mm，ˉx±s)Tab 1 Antibacterial activity of different extracts of Sanhuang Xiexin decoction and Coptis chinensis (mm，ˉx±s)

2.2 三黃瀉心湯組方乙醇提取物紫外光照射穩(wěn)定性測定結(jié)果

三黃瀉心湯組方乙醇提取物經(jīng)紫外光不同時間照射后與未照射處理對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有穩(wěn)定的抑制作用，見表2。

表2 不同時間紫外光照處理的三黃瀉心湯組方乙醇提取物抑菌效應(yīng)(mm，ˉx±s)Tab 2 Effect of ultraviolet exposure time on antibacterial activities of ethanol extracts of Sanhuang Xiexin decoction (mm，ˉx±s)

2.3 三黃瀉心湯組方醇提取物溫度穩(wěn)定性測定結(jié)果

三黃瀉心湯組方醇提取物經(jīng)不同溫度處理后與未加熱處理對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均具有穩(wěn)定的抑制作用，見表3。

3 討論

3.1 提取溶媒

傳統(tǒng)湯劑以水為提取溶媒進行煎煮，隨著現(xiàn)代生產(chǎn)工藝技術(shù)的不斷改進，出現(xiàn)了多種提取手段及多種溶媒用于中藥提取，水、乙醇是最常用的提取溶媒［2-3］。三黃瀉心湯由大黃、黃連、黃芩3 味中藥組成，其水提取物具有清熱瀉火解毒、化瘀涼血止血之功效，其乙醇提取物的生物活性尚未見報道。有研究表明，黃連、黃芩和大黃80%乙醇提取物對大腸埃希菌的抑菌活性分別強于各自的水提取物，而黃連、黃柏和黃芩配伍后的80%乙醇提取物對大腸埃希菌的抑菌活性也強于其水提取物［4］。含有黃連的方劑，其乙醇提取物的抑菌活性強于水提取物［5-7］。本研究結(jié)果顯示，三黃瀉心湯75%乙醇提取物對目標(biāo)菌的抑制活性強于水提取物。

表3 不同溫度處理的三黃瀉心湯組方乙醇提取物抑菌效應(yīng)(ˉx±s)Tab 3 Effect of temperature on antibacterial activities of ethanol extracts of Sanhuang Xiexin decoction (ˉx±s)

3.2 藥理作用

黃連與大黃配伍時，小劑量大黃可增強抑制大腸埃希菌的作用，大劑量則抑菌作用消失［8］。在抑制細(xì)菌生長的同時，黃連促進大腸埃希菌內(nèi)毒素釋放，大黃卻能減少其釋放［9］。黃連還有抑制細(xì)菌呼吸和核酸合成的作用［10］。黃芩素對金黃色葡萄球菌有顯著抑制作用，其抑菌作用是通過影響細(xì)胞膜通透性、抑制菌體內(nèi)蛋白質(zhì)合成、抑制細(xì)菌代謝和DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶等多靶點實現(xiàn)的［11］。本研究結(jié)果顯示，三黃瀉心湯的2 種溶媒提取物的抑菌活性均高于黃連乙醇提取物，提示黃芩、大黃與黃連在對目標(biāo)菌的抑制方面具有協(xié)同作用。常金花［12］研究了三黃分散片在正常、發(fā)熱和發(fā)炎模型大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)，結(jié)果表明，黃芩苷可能與大鼠足跖腫脹度下降有關(guān)，蘆薈大黃素可能與發(fā)熱大鼠體溫下降有關(guān)，大黃酸可能會引起大鼠體溫升高。黃連-黃芩和黃連-大黃配伍的乙醇提取物抑菌活性卻低于黃連乙醇提取物，提示黃芩、大黃對黃連的抑菌有一定的拮抗作用。本研究中，三黃瀉心湯水和乙醇提取物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均有抑菌活性，但其乙醇提取物抑菌活性強于水提取物，可用于進一步的醫(yī)藥研發(fā)。中藥不同配伍及不同提取方式可增加抗菌效果，也能有效減緩抗藥性的發(fā)生，藥材的不同炮制方式對提取工藝也有影響，在三黃瀉心湯方劑中采用何種炮制方式能達到最佳抑菌效果應(yīng)進行進一步研究。

3.3 本研究應(yīng)用前景

以三黃瀉心湯為處方的制劑，包括三黃瀉心湯、三黃片、一清顆粒、膠囊等，制備工藝均以水作為提取溶媒。本研究結(jié)果顯示，三黃瀉心湯75%乙醇提取物具有很好的抑菌效果，且對溫度和紫外光照射穩(wěn)定。在現(xiàn)代成分、藥理研究基礎(chǔ)上，設(shè)計更科學(xué)、合理的制備工藝、適用劑型、給藥途徑，制定科學(xué)、嚴(yán)格、可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證藥品的質(zhì)量穩(wěn)定性，可為三黃瀉心湯的再次開發(fā)提供依據(jù)。

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