向 蓉 ，張瑞堂，康玉龍，李生文，金永新#(.甘肅省第二人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000;.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

抑郁癥是一種以持續(xù)情緒低落為主要癥狀的疾病，隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，生活和工作壓力的增大，其已成為除心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病之外又一影響人類健康的常見、多發(fā)?。?］。目前，抗抑郁治療主要以化學(xué)藥為主，有效率為60% ～70%，且不良反應(yīng)多［2］。中藥具有多途徑、多靶點、綜合治療的特點，因此，有很好的治療優(yōu)勢［3］。黃花寧神顆粒源于臨床經(jīng)驗方，由黃花、合歡花、石菖蒲、茯神、百合、甘草、大棗等12 味中藥按比例組成，具有疏肝解郁、醒腦開竅的功效，臨床一直以傳統(tǒng)煎劑應(yīng)用，具有質(zhì)量不易控制、服用量大、攜帶不便等缺點［4］。為了更好地控制質(zhì)量，保證療效，對其進行水提取工藝優(yōu)選，將其開發(fā)成復(fù)方新制劑。本研究采用L9(34)正交試驗設(shè)計，以出膏率和槲皮苷含量為評價指標(biāo)，結(jié)合生產(chǎn)實際，綜合考慮確定黃花寧神顆粒的最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器:LC-10AT 液相色譜儀、SPD-M10AVP 二極管陣列檢測器、CBM-10A 系統(tǒng)控制器(日本Shimadzu 公司)，RX-95 熱空氣消毒箱(連云港市醫(yī)療設(shè)備廠)，ALC-210.4 電子分析天平(ACCULAB Sartorius 公司)，B1210E-MT 超聲儀(美國Brason Ultrsonics 公司)，800 型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)等。

1.1.2 試劑:槲皮苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:111538-200504)，甲醇為色譜純(天津市光復(fù)精細化工研究所)，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 正交試驗設(shè)計:根據(jù)預(yù)試驗及文獻［5-6］，以出膏率和槲皮苷含量為綜合評價指標(biāo)，選擇加水量(A，倍數(shù))、回流時間(B，h)、回流次數(shù)(C，次)為考察因素，每個因素取3 個水平，采用L9(34)正交設(shè)計進行試驗，見表1。

表1 提取工藝因素與水平Tab 1 Factors and levels of extraction technology

1.2.2 樣品制備:取處方12 味中藥適量，加水浸泡30 min 后按L9(34)正交設(shè)計表(見表2)進行回流提取，過濾，合并提取液，靜置過夜，濾過，濃縮定容成50 ml 浸膏，備用。

1.2.3 出膏率測定:精密吸取按L9(34)正交設(shè)計表進行提取的樣品浸膏20 ml，置于105 ℃干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥至恒質(zhì)量，迅速稱定質(zhì)量，按下式計算出膏率:出膏率=干浸膏質(zhì)量×5/(中藥質(zhì)量×2)×100%。

1.2.4 槲皮苷含量測定［7-8］:(1)色譜條件:色譜柱為Phenomenex C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相為甲醇∶0.1%磷酸溶液(45∶55，V∶V);檢測波長為256 nm;流速為1.0 ml/min;進樣量為15 μl;柱溫為常溫。(2)標(biāo)準曲線及線性關(guān)系考察:精密稱取槲皮苷對照品11.0 mg，溶解并定量轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1 ml置于10 ml 容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為110 μg/ml 的對照品溶液。精密吸取槲皮苷對照品溶液2、4、6、8、10、12 μl，分別進樣測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準曲線。(3)方法學(xué)驗證:精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液，分別進樣測定峰面積。在穩(wěn)定性試驗中分別于0、2、4、6、8、12 h 取樣分析，測定槲皮苷峰面積，計算RSD。(4)樣品含量測定:分別取“1.2.3”項下按正交試驗所得干膏1 g，研細，精密稱定，加甲醇適量，超聲提取，離心10 min，取上清液，用甲醇稀釋至25 ml，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品，分別進樣測定峰面積，代入回歸方程計算槲皮苷含量。

1.2.5 工藝驗證:根據(jù)正交試驗結(jié)果，按確定的最佳工藝條件投料3 批進行工藝驗證，測定槲皮苷峰面積，計算槲皮苷質(zhì)量分數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 出膏率測定結(jié)果

出膏率測定結(jié)果見表2。

表2 提取工藝正交試驗結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal test of extraction technology

2.2 標(biāo)準曲線及線性關(guān)系

回歸方程為Y=4 ×106X-92 749，r=0.999 8，結(jié)果表明槲皮苷的量在0.22 ～1.32 μg 與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3 方法學(xué)驗證結(jié)果

陰性對照無干擾，見圖1。日內(nèi)和日間精密度試驗表明，所得RSD均＜2.05%(n=5);對同一供試品溶液中槲皮苷含量的重復(fù)性試驗表明，RSD=2.14%(n=6);穩(wěn)定性試驗計算得RSD= 1.87% (n= 6)。平均回收率為98.83%，RSD=2.83%(n=6)。表明方法的專屬性、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，可用于樣品中槲皮苷含量的測定。

圖1 黃花寧神顆粒及對照品高效液相色譜圖Fig 1 HPLC of Huanghua Ningshen granules and its standard substance

2.4 結(jié)果分析

正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。結(jié)果表明，以出膏率為考察指標(biāo)，各因素影響程度由大至小依次為回流次數(shù)(C)、回流時間(B)、加水量(A)，最佳水提工藝條件為A3B3C3，即加10 倍量的水，回流1.5 h，回流3 次;以槲皮苷含量為考察指標(biāo)，各因素影響程度由大至小依次為加水量(A)、回流時間(B)、回流次數(shù)(C)，最佳水提工藝條件為A2B3C2，即加8 倍量的水，回流1.5 h，回流2 次。因加水量對槲皮苷的影響程度最大，對出膏率影響最小;在有效成分明確的前提下主要考慮槲皮苷的含量;結(jié)合大生產(chǎn)中節(jié)約成本的角度，所以經(jīng)綜合考慮確定選擇提取條件為A2B3C2，即加8 倍量的水，回流1.5 h，回流2 次。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of analysis of variance

2.5 工藝驗證結(jié)果

槲皮苷質(zhì)量分數(shù)分別為0.174 9、0.177 1、0.168 1 mg/g，RSD=2.70%(n=3)，表明提取工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

3 討論

黃花寧神顆粒處方中君藥黃花又稱萱草，其水提物對小鼠抑郁癥的強迫游泳模型、懸尾模型和拮抗利血平所致的抑郁癥模型均有顯著治療作用［9］，水提物較醇提物減少小白鼠自發(fā)活動的作用更為明顯［10］;合歡花水提物對“行為絕望”動物模型具有明顯抗抑郁作用［11-12］。臨床一直以煎劑應(yīng)用，故對其進行水提取工藝優(yōu)選。

黃花含有的金絲桃苷具有抗抑郁作用［13-14］，合歡花中槲皮苷具有鎮(zhèn)靜、催眠作用［15-16］。預(yù)試驗中因金絲桃苷與黃花中另一成分蘆丁保留時間相同，很難快速分離，而槲皮苷可以快速分離，且與雜質(zhì)峰分離度好，陰性對照無干擾，故選擇槲皮苷為優(yōu)化提取工藝正交試驗考察指標(biāo)之一。

中藥提取的出膏率與制劑質(zhì)量和生產(chǎn)密切相關(guān)，故本研究以出膏率和槲皮苷含量作為考察指標(biāo)，控制黃花寧神顆粒質(zhì)量，綜合考慮最終選擇提取條件為A2B3C2，即加8 倍量的水，回流1.5 h，回流2 次，經(jīng)過工藝驗證，該提取工藝合理，穩(wěn)定可行，可用于黃花寧神顆粒的研制。

［1］ Zhang HL. Treatment of depression based on differentiation of the Shaoyang channels［J］.J Tradit Chin Med，2010，30(2):83-92.

［2］ Gershon AA，Dannon PN，Grunhaus L. Transcranial magnetic stimulation in the treatment of depression［J］. Am J Psychiatry，2003，160(5):835-845.

［3］ 戴建國，王中立，陳琳，等.助陽寧神方拮抗皮質(zhì)酮致抑郁作用機制實驗研究［J］. 東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，31(2):170-173.

［4］ 汪玥，許鋒，李金祝.現(xiàn)代中藥研究存在問題與改進措施［J］.實用醫(yī)藥雜志，2012，29(5):428-429.

［5］ 彭凱麗，李新民，李元林，等.正交試驗優(yōu)選復(fù)方桑菊口服液中藥材的提取工藝［J］.中國藥房，2014，25(3):243-245.

［6］ 李卿，周興，歐燕，等.正交試驗優(yōu)選麻芎平喘顆粒中藥材的提取工藝［J］.中國藥房，2014，25(15):1377-1379.

［7］ 俞建平，馬臨科，鄭建寶. HPLC 測定合歡花中槲皮苷的含量［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2008，25(6):539-540.

［8］ 王海嶺，王清溪，黃洪勇，等.合歡花中槲皮苷的含量測定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21(4):869-870.

［9］ 賀弋，韓珍，楊俊，等.萱草花抗抑郁作用的實驗研究［J］. 寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2008，30(8):682-683.

［10］ 郭冷秋，張穎，張博，等.萱草根及萱草花的化學(xué)成分和藥理作用研究進展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31(1):74-76.

［11］ 康健，李作平，沈立茹.正交試驗法優(yōu)選合歡花提取工藝的研究［J］.中成藥，2007，29(6):902-904.

［12］ 李作平，趙丁，任雷鳴，等.合歡花抗抑郁作用的藥理實驗研究初探［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，24(4):214-216.

［13］ Zheng MZ，Liu CM，Pan FG，et al. Antidepressant-like effect of hyperoside isolated from Apocynum venetum leaves:Possible cellular mechanisms［J］.Phytomedicine，2012，19(2):145-149.

［14］ 潘紅.萱草花化學(xué)成分與質(zhì)量控制研究［D］.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

［15］ Butterweck V，Nishibe S，Sasaki T，et al. Antidepressant effects of apocynum venetum leaves in a forced swimming test［J］.Biol Pharm Bull，2001，24(7):848-851.

［16］ 耿紅梅.合歡花黃酮類化學(xué)成分的研究［J］. 衡水學(xué)院學(xué)報，2011，13(1):28-29.