史國娟賀燕勤于顧然

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇南京210017；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

補腎益精方含藥血清對D-半乳糖致原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷影響的研究

史國娟1賀燕勤2于顧然3

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇南京210017；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇南京210029）

目的：探討補腎益精方含藥血清對D-半乳糖致原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用機制。方法：將培養(yǎng)第6天的原代神經(jīng)元分成5組（空白組、D-半乳糖模型組和補腎益精方低、中、高劑量組），分別加相應(yīng)藥物處理后檢測各組的超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、NO含量，并用MTT法檢測各組細(xì)胞活性。結(jié)果：補腎益精方高、中、低劑量組SOD、GSH-Px水平明顯高于D-半乳糖模型組（P＜0.01，P＜0.001），而LDH、MDA和NO水平明顯低于D-半乳糖模型組（P＜0.001）。MTT檢測細(xì)胞活性，補腎益精方各劑量組也明顯高于D-半乳糖模型組（P＜0.05，P＜0.001）。結(jié)論：補腎益精方含藥血清通過抑制D-半乳糖引起的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，減輕其神經(jīng)毒性作用。

補腎益精方 含藥血清 腦神經(jīng)元 氧化應(yīng)激 細(xì)胞活性

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種原發(fā)性大腦神經(jīng)退行性病變，其典型的組織病理學(xué)改變是老年斑（SP）和神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFT）[1]。氧化應(yīng)激-自由基損傷理論，是AD形成的重要機理之一。D-半乳糖可使動物出現(xiàn)衰老和智力低下的表現(xiàn)，常用于制作癡呆和衰老動物模型[2-4]。另外，D-半乳糖致原代培養(yǎng)的神經(jīng)元損傷模型，也可用于AD藥理研究[5]。補腎益精方由元代宮廷醫(yī)家許國禎的《御藥院方》神仙六子丸化裁而來，于顧然教授根據(jù)《難經(jīng)》“損其腎者益其精”理論，運用補腎益精方治療阿爾茨海默病取得較好的臨床療效[6]。本實驗探討該方含藥血清對D-半乳糖引起的原代神經(jīng)元凋亡的影響，并從氧化應(yīng)激角度探討其作用機理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠30只，體重（250±10）g，由江蘇省中醫(yī)院實驗動物中心提供；16～18d胚鼠，由南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 補腎益精方由江蘇省中醫(yī)院制劑室制成顆粒劑，藥物組成:菟絲子、蛇床子、覆盆子、楮實子、熟地黃、人參、茯苓、白術(shù)、海風(fēng)藤、石菖蒲（1∶1∶1∶1∶2∶1∶3∶1∶1∶0.6）。D-半乳糖（Galactose，C6H12O6），美國SIGMA公司；B27 SUPPLEMERT、NeuroBasal Medium、DMEM/F12液體培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗，均購自美國GIBCO公司；胎牛血清，杭州四季青制品公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT），美國SIGMA公司；一氧化氮（NO）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶 （SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒，均購自南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所。1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（德國BINDER）、萬能顯微鏡（Olympus）、倒置相差顯微鏡（德國LEICA）、精密天平（Mettler Switzerland）、酶聯(lián)免疫檢測儀（瑞士TECAN）、高速冷凍離心機 （美國Beckman-Coulter）、恒溫水浴鍋（中國華儀儀器公司）、多聚賴氨酸（美國SIGMA公司）。

2 實驗方法

2.1 補腎益精方含藥血清的制備 臨用按給藥劑量=臨床常用量×動物等效劑量系數(shù)（按體表面積）×培養(yǎng)基內(nèi)稀釋度[7-8]，制成濃度為1.5g/mL的水煎液，4℃保存。30只大鼠隨機分為空白組和補腎益精方給藥組，每日灌胃1次生理鹽水或補腎益精方水煎液，劑量為每日2mL/只，連續(xù)給藥7d。末次給藥后禁食24h，腹主動脈取血，6000r/min離心 10min，56℃水浴鍋30min滅活后用0.45μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 原代神經(jīng)元的培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[9]原代神經(jīng)元培養(yǎng)方法。接種前用多聚賴氨酸鋪板，在冰上無菌操作，取18～22d胚鼠大腦15個，無菌條件下取腦，分離皮層神經(jīng)元，用冰浴D-Hank’s液洗2次，切成小塊，剪碎，0.125%胰蛋白酶2mL，37℃消化30min，每5min振蕩1次。用等體積含10%胎牛血清的DMEM終止消化，吹打成細(xì)胞懸液，1000r/min離心10min，棄上清，吹打分散細(xì)胞，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾。加入皮層神經(jīng)元培養(yǎng)液，即在NeuroBasal Medium培養(yǎng)基中加入2%B27SUPPLEMERT+10%的胎牛血清和1%雙抗（100U/mL鏈霉素，100U/mL青霉素）。將細(xì)胞懸液稀釋至所需密度接種于用0.1mg/mL多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)板。置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后加入終濃度為10μmol/L阿糖胞苷作用24h更換新培養(yǎng)液，以后每天半量換液，培養(yǎng)6d的皮層神經(jīng)元用于實驗。倒置相差顯微鏡下觀察到原代培養(yǎng)神經(jīng)元三個生長發(fā)育階段:成活階段——第1～3日，所有細(xì)胞均存活，消除非神經(jīng)元后，神經(jīng)元迅速分化，出現(xiàn)神經(jīng)元的形態(tài)特征；成熟并穩(wěn)定階段——第4～6日，神經(jīng)元已充分分化，并維持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

2.3 實驗分組 在D-半乳糖致原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的實驗中，我們將D-半乳糖稀釋成不同濃度:0.1、1、10、20、30、50mg/mL，利用MTT方法確立D-半乳糖損傷細(xì)胞模型的最佳濃度為10mg/mL。為了探討補腎益精方含藥血清對D-半乳糖致原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的作用及是否存在濃度依賴性，我們將含藥血清干預(yù)組分為3種劑量:補腎益精方低劑量組（10%補腎益精方含藥血清+20%的正常血清+70%培養(yǎng)液+D-半乳糖）、補腎益精方中劑量組（20%補腎益精方含藥血清+10%的正常血清+70%培養(yǎng)液+D-半乳糖）和補腎益精方高劑量組（30%補腎益精方含藥血清+70%培養(yǎng)液+D-半乳糖）。另設(shè)不加D-半乳糖的空白組 （30%的正常血清+70%培養(yǎng)液）和不加含藥血清的D-半乳糖模型組（30%的正常血清+70%培養(yǎng)液+D-半乳糖）

2.4 MTT實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔。待24h細(xì)胞貼壁后，按照“2.3實驗分組”部分進(jìn)行加藥。在D-半乳糖致原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的實驗中，將貼壁后的細(xì)胞與D-半乳糖共孵育24h，避光加入MTT溶 液 （5mg/mL）， 每 孔101μL，繼續(xù)在37℃條件下孵育4h。4h后棄上清，每孔加入DMSO 100μL，置于搖床上振搖10min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上492nm波長處測定各孔 OD值。在補腎益精方含藥血清對D-半乳糖致原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞損傷的實驗中，先將貼壁后的細(xì)胞與補腎益精方含藥血清預(yù)孵2h，然后再加入D-半乳糖，按上述步驟操作。

2.5 生化指標(biāo)檢測 按試劑盒說明書，分別檢測各組神經(jīng)元SOD、MDA、NO、LDH和GSH-PX水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0處理，各組數(shù)據(jù)以（±s）表示，用t檢驗比較組間差別，P＜0.05為差異有顯著性意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組神經(jīng)元細(xì)胞活性比較 結(jié)果見表1。D-半乳糖可以使原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞的生存活力下降，補腎益精方對D-半乳糖致原代神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。

表1 各組神經(jīng)元細(xì)胞活性比較（±s）

表1 各組神經(jīng)元細(xì)胞活性比較（±s）

注：與空白組比較，▲▲▲P＜0.001；與D-半乳糖模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001；與補腎益精方低劑量組比較，△△△P＜0.001；與補腎益精方中劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只） 補腎益精方含藥血清OD值空白組6-0.7395±0.0490 D-半乳糖模型組 0.3293±0.0647▲▲▲補腎益精方低劑量組 0.4106±0.0573*補腎益精方中劑量組 0.4682±0.0147***補腎益精方高劑量組 0.5682±0.0573***△△△#6 -6 10μL 6 20μL 6 30μL

3.2 各組皮層神經(jīng)元SOD活性與GSH-Px活性比較 結(jié)果見表2。與空白組相比，D-半乳糖模型組皮層神經(jīng)元SOD活性與GSH-Px活性明顯降低 （P＜0.01，P＜0.001），提示D-半乳糖介導(dǎo)的自由基損傷降低了皮層神經(jīng)元SOD與GSH-Px活性。給予補腎益精方含藥血清可使D-半乳糖模型的皮層神經(jīng)元SOD與GSH-Px活性顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），且存在一定劑量依賴性。

表2 各組皮層神經(jīng)元SOD、GSH-pX活性比較（±s）

表2 各組皮層神經(jīng)元SOD、GSH-pX活性比較（±s）

注：與空白組比較，▲▲▲P＜0.001；與D-半乳糖模型組比較，**P＜0.01，***P＜0.001；與補腎益精方低劑量組比較，△P＜0.05，△△△P＜0.001；與補腎益精方中劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只） 補腎益精方含藥血清空白組 6 SOD（U/mL）-GSH-pX（U）0.7527±0.03510.6995±0.0211 D-半乳糖模型組 6補腎益精方低劑量組 6補腎益精方中劑量組 6補腎益精方高劑量組 6 -0.2963±0.0642▲▲▲0.3126±0.0713▲▲▲10μL 0.4107±0.0552**0.4106±0.0553**20μL 0.4681±0.0146***△0.4682±0.0147***△30μL 0.5351±0.0065***△△△#0.5349±0.0068***△△△#

表3 各組皮層神經(jīng)元NO、MDA、LDH值比較（±s）

表3 各組皮層神經(jīng)元NO、MDA、LDH值比較（±s）

注：與空白組比較，▲▲▲P＜0.001；與D-半乳糖模型組比較，***P＜0.001；與補腎益精方低劑量組比較，△P＜0.05，△△△P＜0.001；與補腎益精方中劑量組比較，#P＜0.05。

組別 動物數(shù)（只）補腎益精含藥血清 NO（μmol/L）MDA（nmol/mL）空白組 6- 0.2684±0.0375 LDH（U/L）0.2022±0.00930.2604±0.03901 D-半乳糖模型組 6補腎益精方低劑量組 6補腎益精方中劑量組 6補腎益精方高劑量組 6 - 0.6339±0.0166▲▲▲10μL 0.4552±0.0242***20μL 0.3535±0.0444***△△△30μL 0.3434±0.0489***△△△0.5353±0.0097▲▲▲0.5669±0.0542▲▲▲0.4590±0.0184***0.4924±0.0647***0.3985±0.0522***△0.4152±0.0525***△0.3251±0.0700***△△△0.3417±0.0625***△△△#

3.3 各組皮層神經(jīng)元MDA、LDH與NO含量比較

見表3。與空白組比較，D-半乳糖模型組皮層神經(jīng)元MDA、LDH與NO水平明顯升高（P＜0.001）。給予補腎益精方含藥血清可使皮層神經(jīng)元MDA、LDH與NO水平顯著下降（P＜0.001），且存在一定劑量依賴性。

4 討論

氧化應(yīng)激和凋亡被認(rèn)為是阿爾茨海默病主要的致病機制。機體在遭受有害刺激時，活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）產(chǎn)生過多，大量生成的ROS或RNS不僅可以直接攻擊細(xì)胞生物膜，引起神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)具有酶原活性蛋白質(zhì)的變性，損傷細(xì)胞核內(nèi)或線粒體內(nèi)的DNA等，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡。SOD、GSH-Px是機體兩種重要的抗氧化酶，可對抗并阻斷因氧化自由基對組織細(xì)胞造成的損害，并及時修復(fù)受損組織細(xì)胞。MDA是脂質(zhì)過氧化的終末代謝產(chǎn)物，可反映機體受ROS攻擊的程度。另外，MDA的自身毒性，也是導(dǎo)致AD發(fā)病過程中神經(jīng)元細(xì)胞變性壞死凋亡的重要原因[10]。LDH廣泛存在于組織細(xì)胞內(nèi)，正常細(xì)胞幾乎不釋放LDH，其釋放量的多少可反映細(xì)胞膜的完整性，因此LDH活性增加為細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志之一。NO是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中一種重要的生物信使分子，在CNS中具有雙重作用，過量的NO則會作為強氧化劑與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性從而導(dǎo)致衰老的發(fā)生[11]。

D-半乳糖是一種二醛糖，它在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇和H2O2，同時在反應(yīng)過程中產(chǎn)生超氧陰離子，過量的氧自由基在動物體內(nèi)可與細(xì)胞中的脂質(zhì)、蛋白和核酸產(chǎn)生非酶糖基化、氧化應(yīng)激-自由基損傷作用及誘導(dǎo)醛糖還原酶活性增強等一系列病理改變，從而導(dǎo)致衰老。大腦特別容易氧化是因為它的高代謝率和低抗氧化能力[12]。自由基學(xué)說是重要的衰老學(xué)說之一[13]。D-半乳糖可致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，常注射于動物腦區(qū)，用于制作癡呆的動物模型。

本研究運用D-半乳糖制作氧化應(yīng)激致AD的細(xì)胞模型，以補腎益精方含藥血清干預(yù)該細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)補腎益精方含藥血清可提高D-半乳糖損傷的原代培養(yǎng)神經(jīng)元抗氧化酶SOD與GSH-Px活性，降低脂質(zhì)過氧化分解產(chǎn)物MDA與強氧化劑NO的含量，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡及LDH釋放，提高神經(jīng)細(xì)胞存活率。并且，隨著補腎益精方含藥血清濃度的增加，其抗氧化應(yīng)激及神經(jīng)元保護(hù)作用也相應(yīng)增強。即補腎益精方可以通過減少細(xì)胞凋亡對D-半乳糖損傷原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞起保護(hù)作用，補腎益精方抗凋亡作用是通過其抗氧化應(yīng)激反應(yīng)來實現(xiàn)的，且其作用強度呈濃度依賴性。

本研究結(jié)果為臨床推廣補腎益精方防治阿爾茨海默病提供了實驗室依據(jù)，但本研究只從體外細(xì)胞水平揭示補腎益精方減輕氧化應(yīng)激、保護(hù)損傷的神經(jīng)元等作用，由于癡呆有多種形成機制，包括炎癥因子、凋亡、自噬等，而中藥作用是多靶點的，減輕氧化應(yīng)激只是其作用的一個方面。下一步的研究將針對本方的抗凋亡作用，研究其對凋亡信號通道——絲裂原活化蛋白激酶信號通道的影響；另外，除了體外細(xì)胞培養(yǎng)研究之外，我們還將探討該方在動物體內(nèi)減輕腦細(xì)胞凋亡的機制，以期更全面地揭示該方治療癡呆的機理。

[1] Armstrong RA.The molecular biology of senile plaques and neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease.Folia Neuropathol，2009，47（4）：289

[2] Cui X，Zuo P，Zhang Q，et al.Chronic systemic D-galactose exposure induces memory loss，neurodegeneration，and oxidative damage in mice：protective effects of R-alphalipoic acid.J Neurosci Res，2006，84（3）：647

[3] Yoo DY，Kim W，Lee CH，et al.Melatonin improves D-galactose -induced aging effects on behavior，neurogenesis，and lipid peroxidation in the mouse dentate gyrus via increasing pCREB expression.J Pineal Res，2012，52（1）：21

[4] Xian YF，Lin ZX，Zhao M，et al.Uncaria rhynchophylla ameliorates cognitive deficits induced by D-galactose in mice.Planta Med，2011，77（18）：1977

[5] 蔡大勇，趙雁，黃啟福.D-半乳糖致原代培養(yǎng)神經(jīng)元損傷模型的建立.中國病理生理學(xué)雜志，2002，18（6）：18

[6] 賀燕勤，于顧然.運用《難經(jīng)》“益精”理論治療癡呆探討.陜西中醫(yī)，2012，33（6）：746

[7] 李義奎.中藥藥理實驗方法學(xué).上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：50

[8] 孟李，王寧生.含藥血清的制備方法研究.中藥新藥與臨床藥理，1999，10（5）：290

[9] 司徒鎮(zhèn)強，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng).西安：世界圖書出版公司，1999：121，181

[10] CioancaO，Hritcu L，Mihasan M，etal.Cognitiveenhancing and antioxidant activities of inhaled coriander volatile oil in amyloid β（1-42）rat model of Alzheimer's disease.Physiol Behav，2013（120）：193

[11] Luth HJ，HolzerM，GartnerU，etal．Expression of endothelial and inducible NOS-isoforms is increased in Alzheimer's disease，in APP23 transgenic mice and after experimental brain lesion in rat：evidence for an induction by amyloid pathology．Brain Res，2001，913（1）：57

[12] Reynolds A，Laurie C，Mosley RL，et al.Oxidative stress and the pathogenesis of neurodegenerative disorders. Int Rev Neurobiol，2007，82：297

[13] 李素云，王立芹，鄭稼琳，等.自由基與衰老的研究進(jìn)展.中國老年學(xué)雜志，2007，27（10）：2046

R289.5

A

1672-397X（2015）02-0080-03

史國娟（1987-），女，碩士研究生，中西醫(yī)結(jié)合臨床（神經(jīng)內(nèi)科）專業(yè)。

于顧然，教授，主任中醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。dr.ygrdf@163.com

2014-09-30

編輯：吳 寧

江蘇省中醫(yī)藥管理局基金資助（LZ13027）