張麗君，沈定文

(湖北科技學院基礎醫(yī)學院，湖北 咸寧 437100)

小鼠感染日本血吸蟲后，其肝臟自然病變過程與日本血吸蟲病患者有著極大的相似性［1］，因此，構建穩(wěn)定的小鼠日本血吸蟲病肝纖維化模型對于研究人類日本血吸蟲病肝纖維化的形成、發(fā)展機制以及藥物的治療具有重要意義。本實驗通過構建穩(wěn)定的日本血吸蟲病小鼠肝纖維化模型，觀察小鼠日本血吸蟲病肝纖維化形成、發(fā)展的動態(tài)病理過程，為探討日本血吸蟲病肝纖維化發(fā)病機制和藥物干預實驗用藥時機的選擇提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和釘螺 昆明小鼠，雄性，體質量18～22g，購自湖北省疾病預防控制中心血吸蟲病防治研究所。陽性釘螺，購自湖北省疾病預防控制中心。

1.2 動物造模與取材 昆明小鼠50 只，隨機分為A(對照組)、B(6 周組)、C(8 周組)、D(10 周組)和E(12 周組)。實驗組每只小鼠采用尾蚴敷貼法經皮膚感染血吸蟲尾蚴(20 ±1)條，對照組以不含尾蚴的去氯水進行處理。日本血吸蟲感染后第6 周、第8 周、第10 周、第12 周，分別處死相應小組小鼠進行取材，取材前禁食12h，對照組與12周組同時取材。取材前編號稱重并記錄。動物麻醉后，剝離肝臟，生理鹽水洗去粘附的血液后，用濾紙吸去多余液體，稱量肝臟重量并記錄。分離出的肝臟置入4%甲醛中固定，24h 后進行脫水透明、石蠟包埋。

1.3 觀察指標 肝臟指數按照下面公式計算:肝臟指數(%)=肝臟重量(g)/體重(g)×100%。HE 染色和Masson 染色觀察各實驗組小鼠肝損傷程度和膠原纖維沉積情況。

2 結果

2.1 肝臟指數 與對照組比較，感染后不同時期小鼠肝臟指數都顯著升高(P ＜0.01)，見表1。

表1 小鼠感染日本血吸蟲尾蚴后不同時期肝臟指數的比較()

表1 小鼠感染日本血吸蟲尾蚴后不同時期肝臟指數的比較()

與A組比較，* P ＜0.001

2.2 病理學檢查 HE 染色結果小鼠感染日本血吸蟲6 周后，急性蟲卵肉芽腫形成，肉芽腫周圍有嗜酸性粒細胞為主的各種炎性細胞浸潤;而感染12 周后，蟲卵肉芽腫體積縮小，肉芽腫周圍浸潤的炎性細胞有所減少，周圍變性、壞死的肝細胞數量增多，見圖1(封二)。Masson 染色結果感染6周后，蟲卵肉芽腫內可見少量被染成藍色的膠原纖維。隨著感染的發(fā)展，膠原纖維逐漸增多并且匯及匯管區(qū)，感染12 周后，膠原纖維連接成片，并延伸至肝竇壁，見圖2(封二)。結果表明小鼠感染日本血吸蟲6 周后，肝組織有肉芽腫形成和膠原纖維沉積，感染12 周后，肝纖維化特征明顯。

3 討論

目前仍沒有能夠直接逆轉血吸蟲病肝纖維化的藥物和治療方法，所以，進一步的研究工作仍要繼續(xù)。動物模型，尤其是小鼠血吸蟲病模型是這一領域研究的重要基石［2］，小鼠肝臟在感染日本血吸蟲后發(fā)生的病理變化與人類日本血吸蟲病表現出極大的相似性，此模型能夠較為準確的再現人類日本血吸蟲病肝纖維化發(fā)病的自然過程，無疑是目前研究日本血吸蟲病肝纖維化發(fā)病機制以及研究開發(fā)抗血吸蟲病肝纖維化藥物的較為理想的實驗動物模型。各國學者應用這一模型對血吸蟲病進行的多方面的研究，包括組織生物學、病理學、藥理學、免疫學、藥物篩選和疫苗開發(fā)等。

日本血吸蟲尾蚴經皮膚感染進入小鼠體內，同時斷尾轉變?yōu)橥x，童蟲在宿主體內移行、生長發(fā)育為成蟲，最后寄居于小鼠門靜脈-腸系膜靜脈系統中。成蟲除了會對機體造成一些機械損傷外一般無明顯的致病作用，但它所產生的蟲卵經門靜脈沉積肝臟會對宿主產生嚴重的病理損害。日本血吸蟲尾蚴一般在感染宿主24d 后可發(fā)育為成蟲開始產卵，4 周后開始沉積肝臟，但此時的未成熟的蟲卵并沒有抗原活性，要經過大約11d 的時間發(fā)育為成熟的蟲卵才具有抗原活性，成熟的蟲卵可釋放SEA 到周圍組織中，經APC 處理并呈遞給輔助性T 細胞(Th)，致敏的Th 再次受到相同的抗原刺激后，可產生釋放多種淋巴因子，引起以巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、MFB 等細胞聚集為特征的炎癥肉芽腫性反應。血吸蟲病肝纖維化就是在蟲卵肉芽腫的基礎上逐漸發(fā)展形成的［3～5］。蟲卵肉芽腫的大小、數量與血吸蟲病病理損害的嚴重程度有著直接的關系。蟲卵肉芽腫的形成是宿主對蟲卵的一種免疫應答［6，7］。一方面，它可相對延長宿主的生命，隔離和清除SEA，使宿主不過早死亡;另一方面，宿主正常的組織結構被不斷生成的蟲卵肉芽腫破壞，并相互連接形成疤痕，導致肝纖維化甚至肝硬化。同時，隨著病情的發(fā)展，肝內廣泛分布的蟲卵破裂或鈣化，刺激周圍類上皮細胞逐漸演變?yōu)槌衫w維細胞，分泌大量膠原纖維，進一步加重肝纖維化。

本實驗通過構建穩(wěn)定的日本血吸蟲病肝纖維化的疾病模型，觀察昆明小鼠在感染日本血吸蟲尾蚴后，肝臟組織隨時間而發(fā)生病理改變。結果小鼠感染日本血吸蟲6 周后，急性蟲卵肉芽腫內有少量膠原纖維。感染8 周，蟲卵肉芽腫周圍有明顯的膠原纖維沉積。感染12 周，肉芽腫病灶周圍出現明顯的肝纖維化特征。隨著病程發(fā)展，小鼠肝臟組織的肝纖維化程度呈進行性加重，膠原纖維含量也逐漸增加，且膠原沉積部位與蟲卵肉芽腫位置密切相關。結果表明小鼠感染日本血吸蟲6 周后，肝組織有肉芽腫形成和膠原纖維沉積，可作為藥物干預實驗開始用藥時機的標志。

［1］張彬彬，蔡衛(wèi)民，陶君，等.吡喹酮聯合γ-干擾素治療對日本血吸蟲性肝纖維化小鼠Smads 蛋白表達的影響［J］.Chinese Hepatology，2014，19(5):356

［2］Abdul-Ghani RA，Hassan AA.Murine schistosomiasis as a model for human schistosomiasis mansoni:similarities and discrepancies［J］.Parasitol Res，2010，107(1):1

［3］Friedman SL.Hepatic fibrosis-overview［J］.Toxicology，2008，254(3):120

［4］Bartley PB，Ramm GA，Jones MK，et al.A contributory role for activated hepatic stellate cells in the dynamics of schistosoma japonicum egg induced fibrosis［J］.Int J Parasitol，2006，36(9):993

［5］Chang D，Ramalho LN，Ramalho FS，et al.Hepatic stellate cells in human schistosomiasis mansoni:acomparative immunohisto-chemical study with liver cirrhosis［J］.Acta Trop，2006，97(3):318

［6］Burke ML，Jones MK，Gobert GN，et al.Immunopathogenesis of human schistosomiasis［J］.Parasite Immunol，2009，31(4):163

［7］Burke ML，McGarvey L，McSorley HJ，et al.Migrating Schistosoma japonicum schistosomula induce an innate immune response and wound healing in the murine lung［J］.Mol Immunol，2011，49(1-2):191