陳 元，朱登安，魏曉艷，曹 凱，王銀鳳，吳茜茜

(武警湖北總隊醫(yī)院急診科，湖北 武漢 430064)

心肌缺血再灌注損傷是臨床上常見的病理生理過程，其機制十分復雜?，F(xiàn)已證實，細胞因子釋放，相關基因調(diào)控在心肌缺血再灌注過程中發(fā)揮了重要作用。復方丹參在心血管疾病臨床治療中應用廣泛，可能的機制是保護血管內(nèi)皮細胞，抗心肌缺血作用，改善血液代謝以及對心肌的保護作用。本研究通過大鼠心肌缺血再灌注模型建立，研究復方丹參液對心肌缺血再灌注損傷過程中NF-κB 蛋白活性變化及相關炎性細胞因子表達的影響，探討復方丹參液對心肌保護作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立與分組

1.1.1 動物模型制作 經(jīng)腹腔注射20%烏拉坦(5ml/kg)，麻醉完成后行氣管切開，接呼吸機行機械輔助通氣，沿胸骨左緣進入胸腔，游離左冠狀動脈前降支。用6-0 的絲線套扎左冠狀動脈前降支，絲線穿過一塑料管腔，通過向下推動塑料管壓向心室壁，冠脈血流阻斷;放松絲線冠脈血流再灌注。

1.1.2 實驗動物及分組 SD 雄性大鼠60 只，(PDF 級，武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)，按抽簽法隨機分成3組，每組20 只。A組(假手術對照組):游離冠狀動脈前降支但不結扎;B組(缺血再灌注組):缺血30min，再灌注60min;C組(復方丹參液處理組):于缺血前30min 腹腔注射復方丹參液1.5ml/kg，余同B組。A、B組缺血前30min 注射生理鹽水(1.5ml/kg)。

1.2 檢測方法及觀測指標

1.2.1 心肌梗死面積的測定(TTC 染色) 各組分別取10 只SD 大鼠，其中B組、C組再灌注結束后，將左冠狀動脈前降支重新結扎，從舌靜脈注射0.5%伊文氏藍1.5ml，迅速取左心室心肌，冰凍切片后，行2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色(TTC 染色)。應用HPIAS-2000 圖像分析軟件分別測出缺血區(qū)面積和梗死區(qū)面積;缺血區(qū)面積以心肌缺血區(qū)占左心室面積的百分比表示;梗死區(qū)面積以梗死區(qū)面積占缺血區(qū)面積的百分比表示。

1.2.2 血漿TNF-α、IL-10 的測定(酶聯(lián)免疫吸附實驗，ELISA) 分別采取各組10 只大鼠靜脈血取血清。ELISA 法檢測各組TNF-α、IL-10 血漿濃度(按照試劑盒說明書操作)。

1.2.3 心肌組織NF-κB 活性測定 分別采取各組余下10 只大鼠左心室取心肌提取蛋白，進行SDS-PAGE 蛋白電泳，轉印到PVDF 膜上。加入一抗兔抗大鼠NF-κB p65 多克隆抗體孵育過夜，洗膜后，加入二抗羊抗兔IgG 孵育。將PVDF 膜應用ECL 化學發(fā)光檢測。圖像處理軟件測出條帶灰度值，用以表示NF-κB 蛋白活性。

2 結果

2.1 復方丹參液對缺血再灌注心肌梗死面積的影響 B組梗死面積為(45 ±3)%，C組梗死面積為(30 ±5)%，兩者比較有明顯差異(P ＜0.01)，見表1。

表1 3組心肌缺血面積及梗死面積、血漿TNF-α、IL-10 濃度變化()

表1 3組心肌缺血面積及梗死面積、血漿TNF-α、IL-10 濃度變化()

與B組比較，* P ＜0.01;與A組比較，△P ＜0.01

2.2 復方丹參液對缺血再灌注大鼠血漿炎性細胞因子的影響 缺血再灌注后血漿炎性細胞因子TNF-α、IL-10 濃度分別為(187 ± 12)pg/ml 和(724 ±50)pg/ml，與A組相比均顯著上升(P ＜0.01)。C組血漿TNF-α、IL-10 的濃度分別為(58±6)pg/ml 和(287 ±47)pg/ml，低于B組(P ＜0.01)。見表1。

2.3 心肌NF-κB 的表達活性變化 如圖1 所示，A組心肌NF-κB 活性為(22 ±5)，B組心肌NF-κB活性為(42 ± 4)，與A組相比顯著上升(P ＜0.01)。C組心肌NF-κB 活性為(28 ±4)，低于B組(P ＜0.01)。

圖1 各組心肌NF-κB 蛋白表達

3 討論

缺血再灌注損傷是常見的臨床病理生理現(xiàn)象，缺血再灌注損傷主要病理生理學改變包括:心肌細胞壞死、再灌注性心律失常、心肌收縮功能障礙以及冠狀微循環(huán)障礙［1］。在心肌缺血再灌注損傷的病理生理過程中炎性細胞因子發(fā)揮了重要作用［2］。

TNF-α 能誘導白細胞在組織中聚集、粘附，釋放白三烯、血小板活化因子、IL-10、IL-6 等炎性介質(zhì)。炎性因子TNF-α 在機體體液炎性反應中有啟動、觸發(fā)作用。白細胞和內(nèi)皮細胞的激活粘附是缺血再灌注后心肌病理損傷的關鍵，而TNF-α 是激活這些細胞的主要介質(zhì)。通過離體大鼠心肌灌注模型觀察到了缺血再灌注損傷心肌TNF-α 水平升高［3］。而抑制心肌缺血后TNF-α 的表達，能明顯改善心肌功能和減輕心肌損傷［4］。

IL-10 是炎癥調(diào)控的樞紐位置的重要炎性介質(zhì)，在缺血再灌注損傷中比反應蛋白或肌酸激酶更敏感。研究證實在大鼠急性心肌缺血再灌注時血清中IL-10 呈高表達［5］。在利用IL-10 單克隆抗體治療后可以緩解缺血再灌注損傷的發(fā)生，明顯改善損傷心肌結構，提示IL-10 參與了缺血再灌注損害的病理過程。由此可見，IL-10 在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮了具有重要意義的作用。血漿IL-10 濃度可敏感反應組織損傷的程度，IL-10 水平也與心肌損傷密切相關［6］。

在本實驗中采用經(jīng)典的大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過缺血再灌注刺激后，體內(nèi)循環(huán)中的TNF-α、IL-10 濃度均較對照組明顯增高。

NF-κB 是在炎癥損傷機制中普遍存在的轉錄因子，在調(diào)節(jié)炎癥反應和免疫應答基因中起重要作用。TNF-α、IL-10 兩種細胞因子均受核因子-κB的調(diào)控［7］。本實驗研究顯示NF-κB 的活化，以及隨后的細胞因子的轉錄都參與了心肌缺血再灌注損傷過程，如抑制NF-κB 活性可以減少促炎細胞因子的釋放，減少心肌梗死面積。本實驗結果表明在心肌再灌注后NF-κB 的活性表達水平較對照組明顯上升，血漿中細胞因子IL-10、TNF-α 水平也明顯增加。

復方丹參液是我國傳統(tǒng)的中藥制劑，具有抗炎、抗氧化、保護血管內(nèi)皮細胞作用，同時抑制動脈粥樣斑塊形成，維持內(nèi)膜增生血管內(nèi)皮細胞相關介質(zhì)一氧化氮(NO)和血管收縮因子內(nèi)皮素-1(ET-1)等之間的平衡穩(wěn)定性。復方丹參液能抑制脂質(zhì)過氧化反應，清除心肌損傷中氧自由基，提高心肌對缺氧的耐受性，改善缺氧心肌代謝活力。復方丹參液顯著降低核因子及其調(diào)控的促炎細胞因子TNF-α、IL-10 水平可能與升高缺血再灌注心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性和增強機體的非特異性免疫力，對特異性細胞免疫雙向調(diào)節(jié)作用這兩方面因素有關［8］。

本實驗闡明了復方丹參液可以通過減少心肌核因子-κB 蛋白活化，減少促炎細胞因子的釋放，改善缺氧心肌代謝活力。這可能是其在缺血再灌注心肌保護作用中的分子學機制之一。

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