張玉霖，歐陽昌漢，張又枝

(湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100)

阿爾茨海默病(Alzheimer＇s Disease，AD)/老年性癡呆是老年癡呆最常見的類型，是嚴(yán)重危害老年人身心健康的一類疾病。該病以進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知功能減退，思維障礙為主要癥狀，以大腦皮質(zhì)萎縮、神經(jīng)元丟失等為主要病理改變的神經(jīng)變性病變。伴隨著人口老齡化，AD 發(fā)病率也越來越高，對(duì)人類生活質(zhì)量的影響乃至生命的威脅也日趨嚴(yán)重。因此，深入探討AD 的發(fā)病機(jī)制，研究有效的防治措施是擺在醫(yī)學(xué)界面前迫切需要解決的一項(xiàng)重大課題。

AD 發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，目前有多種假說，如β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)假說、膽堿能損傷假說、自由基損傷假說、能量代謝障礙假說等。由于AD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前還沒有治療AD 的特效藥物，因此開發(fā)高效、低價(jià)的抗AD藥物具有較高的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一類主要存在于藜蘆、葡萄、花生等植物中的非黃酮類多酚類化合物，在中藥虎杖里的含量也很高。研究顯示，白藜蘆醇具有抗炎、抗癌、抗氧化及保護(hù)心血管等多種生物學(xué)活性［1］，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)大鼠模型能很好的模擬阿爾茨海默病(Alzheimer＇s Disease，AD)病的改變［2］，因此常被作為阿爾茨海默病的模型應(yīng)用［3］。

研究證實(shí)，Res 對(duì)AD 小鼠認(rèn)知能力具有一定保護(hù)作用［4］，但對(duì)側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素的AD大鼠是否有保護(hù)作用鮮見報(bào)道，本研究以側(cè)腦室注射鏈脲佐菌素建立AD 大鼠模型，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)白藜蘆醇對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響，為臨床應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar 大鼠50 只，體質(zhì)量200～280g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。白藜蘆醇、鏈脲佐菌素，美國Sigma 公司;其他試劑，分析純。腦立體定位儀、顱骨鉆，美國Stoelting 公司;Morris 水迷宮，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組給藥及模型制作 50 只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、RES Ⅰ組(10mg/kg)、RES Ⅱ組(20mg/kg)和RES Ⅲ組(30mg/kg)每組10 只。造模前，RES Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠分別用3.3mg/ml、6.6mg/ml 和9.9mg/ml 的RES 溶液(20%環(huán)糊精/生理鹽水為溶媒)灌胃;假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠用生理鹽水灌胃;各組均按按體質(zhì)量3ml/(kg·d)灌胃，共持續(xù)2 周。第7d 灌胃后1h，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，參考《大鼠腦立體定向圖譜》［5］，將大鼠的腦袋固定在腦定位儀上，剪去局部毛發(fā)，消毒后沿矢狀線做一長約1.5cm 的切口。除假手術(shù)組外，各組大鼠于中線旁1.4mm，前囟后0.8～0.9mm 處鉆孔，深度3.6mm，每側(cè)側(cè)腦室用微量進(jìn)樣器注射10%STZ(人工腦脊液為溶媒)約3μl/100g，第3d重復(fù)注射此劑量。假手術(shù)組注射等量人工腦脊液以代替10%STZ。每次注入時(shí)間為3min，留針1 min。無菌骨蠟封閉鉆孔，術(shù)區(qū)滴注慶大霉素，縫合消毒。術(shù)后繼續(xù)灌胃給藥，同時(shí)肌注青霉素、慶大霉素共5d 防止感染。

1.2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠記憶能力成模3周，用Morris 水迷宮(MWM)檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。試驗(yàn)分為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)［6］。①定位航行實(shí)驗(yàn):4 個(gè)象限潛伏期的均值作為該天的成績，記為平均逃避潛伏期，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5d。②空間探索實(shí)驗(yàn):第6d 撤除平臺(tái)，從第一象限任選一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入，記錄在120s 內(nèi)大鼠穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù)，計(jì)算1 min 穿越原平臺(tái)的次數(shù)，記錄大鼠在120s 內(nèi)搜索平臺(tái)的路線圖。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 由表1 可知，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組大鼠平均逃避潛伏期均有所縮短;與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組從第2d 開始平均逃避潛伏期明顯延長(P ＜0.01)。與模型對(duì)照組比較，RES 10mg/kg 劑量組第4、5d 平均逃避潛伏期明顯縮短(P ＜0.05 或P ＜0.01);RES 20mg/kg 劑量組第3～5d 平均逃避潛伏期明顯縮短(P ＜0.01);RES 30mg/kg 劑量組大鼠從第2d 開始平均逃避潛伏期明顯縮短(P ＜0.05 或P ＜0.01)。定位航行實(shí)驗(yàn)各組大鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線見圖1。

表1 白藜蘆醇對(duì)AD 模型大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)平均逃避潛伏期的影響(，n=10)

表1 白藜蘆醇對(duì)AD 模型大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)平均逃避潛伏期的影響(，n=10)

與假手術(shù)組比較，* P ＜0.01;與模型對(duì)照組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01

圖1 Morris 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)第5d 各組大鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線圖

2.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 與假手術(shù)組比，模型對(duì)照組大鼠每min 穿越原平臺(tái)位置次數(shù)明顯減少(P ＜0.05);與模型對(duì)照組比，RES(20mg/kg)組和RES(30mg/kg)組組大鼠每min 穿越原平臺(tái)位置次數(shù)明顯增多(P ＜0.05)(圖2)。Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中各組大鼠在120s 內(nèi)搜索平臺(tái)的路線見圖3。

圖2 白藜蘆醇對(duì)AD 模型大鼠Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)每min 穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)的影響()

圖3 Morris 水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中各組大鼠在120s 內(nèi)搜索平臺(tái)的路線圖

3 討論

阿爾茨海默病(Alzheimer＇s Disease，AD)屬彌漫性中樞神經(jīng)退行性疾病，以漸進(jìn)性記憶力減退、認(rèn)知障礙為特征，是老年期常見的疾病。AD 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，嚴(yán)重危害了老年人的身心健康。鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)屬亞硝基脲類衍生物，在外周可以選擇性破壞胰島細(xì)胞致糖尿病;在中樞它可以阻斷胰島素受體的自身磷酸化和酪氨酸激酶的活性，影響胰島素受體的功能［7］，引起大鼠學(xué)習(xí)、記憶損傷［8］。

Morris 水迷宮(Morris water maze)是英國心理學(xué)家Morris 發(fā)明并應(yīng)用于測(cè)試動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的一種裝置。通過隱藏平臺(tái)獲得實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)，采集動(dòng)物的逃避潛伏期、原平臺(tái)象限停留時(shí)間等實(shí)驗(yàn)參數(shù)，衡量與空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦功能，評(píng)價(jià)能影響學(xué)習(xí)記憶的藥物效果［9］。

條件反射是學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)，MWM為訓(xùn)練動(dòng)物形成條件反射提供了條件，動(dòng)物通過迷宮來學(xué)習(xí)任務(wù)，也通過迷宮檢測(cè)記憶能力。目前，Morris 水迷宮仍是篩選癡呆動(dòng)物模型和評(píng)價(jià)藥物效果最可靠的方法之一［10］。經(jīng)典的MWM測(cè)試方法主要包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩部分。我們的MWM 測(cè)試結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比，模型對(duì)照組大鼠第2d 開始定位航行試驗(yàn)平均逃避潛伏期明顯延長，空間探索試驗(yàn)每分鐘穿越原平臺(tái)位置次數(shù)明顯減少，說明側(cè)腦室注射STZ 獲得的AD 模型大鼠，空間認(rèn)知能力明顯損傷，表明了造模的成功;同時(shí)，與模型對(duì)照組比，RES 各組大鼠定位航行試驗(yàn)平均逃避潛伏期一定程度縮短，RES20、30mg/kg 劑量組大鼠空間探索試驗(yàn)每min 穿越原平臺(tái)位置次數(shù)明顯增多，說明RES 有保護(hù)AD 大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用。

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