艾鳳偉， 莊海濤， 凌 勇， 佟 雷， 王 杰*

（1.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇徐州221004；2.臨沂市沂水中心醫(yī)院藥學(xué)部，山東沂水276400；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，山東青島266000；4.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江牡丹江157000）

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化青蒿素微囊的制備工藝

艾鳳偉1， 莊海濤2， 凌 勇3， 佟 雷4， 王 杰1*

（1.徐州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇徐州221004；2.臨沂市沂水中心醫(yī)院藥學(xué)部，山東沂水276400；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，山東青島266000；4.牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江牡丹江157000）

目的優(yōu)化青蒿素微囊的制備工藝，并對制備的青蒿素微囊進行質(zhì)量評價研究。方法以明膠為囊材，單凝聚法制備青蒿素微囊，通過星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化其制備工藝，并對包封率、載藥量、微囊的粒徑分布、體外溶出進行研究。結(jié)果明膠制備青蒿素微囊的最佳工藝條件的明膠質(zhì)量分數(shù)為5.06%，囊心囊材質(zhì)量比為1∶3，攪拌速度為751 r/min。此最佳工藝制備的青蒿素微囊包封率為89.31%，平均粒徑69.91μm，載藥量為22.25%，體外溶出度測定0.5 h為25.8%，12 h累積釋放達到95%以上。結(jié)論以最佳工藝條件制備青蒿素微囊工藝穩(wěn)定，包封率高，同時體外釋放試驗表明，該微囊具有較好的緩釋作用。

青蒿素微囊；星點設(shè)計-效應(yīng)面法；包封率

瘧疾是一種由蚊蟲叮咬或者輸入帶瘧原蟲者的血液而感染瘧原蟲而引起的寄生蟲疾病，是嚴重危害人類健康和生命安全的重大傳染病之一，世界衛(wèi)生組織 （WHO）把瘧疾與艾滋病、結(jié)核病一起列為全球三大公共衛(wèi)生問題［1］。化學(xué)療法是治療瘧疾的最直接最有效的方法，在數(shù)十年的化學(xué)療法治療瘧疾過程中，一部分化學(xué)藥物如綠奎寧、磺胺多辛、乙胺嘧啶等對瘧疾的治療敏感性逐漸降低，化學(xué)療法控制瘧疾幾乎變得難以實現(xiàn)［2-3］。我國科研人員從黃花蒿中提取的青蒿素成為新的替代強效抗瘧藥物，該類藥物對簡單瘧疾和惡性瘧疾都有良好的療效，成為臨床上治療瘧疾疾病的新選擇。目前，以青蒿素類藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法逐漸成為化學(xué)療法治療瘧疾的首選［4］。

青蒿素在水中的溶解度差，消除半衰期短，導(dǎo)致青蒿素的口服給藥的生物利用度僅為30%左右［5］，低水溶性、口服肝臟首過效應(yīng)及生物半衰期短是影響青蒿素臨床療效的主要因素，也是研制青蒿素新制劑的關(guān)鍵。微囊是采用天然或合成的高分子材料為囊材，將固態(tài)或液態(tài)藥物作為囊心物包裹形成的一種微型膠囊。通過微囊化方法形成緩控釋制劑或靶向制劑；從而達到延緩目標藥物在生物體內(nèi)的釋放速度或目標靶向性的目的，本研究以生物大分子明膠作為載體材料制備一種青蒿素緩釋制劑，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法對青蒿素明膠微囊的制備工藝進行優(yōu)化，制備的微囊制劑可降低青蒿素在生物體里的溶出速率，減少患者服藥次數(shù)，增加藥物在生物體內(nèi)的停留時間，提高青蒿素的生物利用度。

1 儀器與材料

1.1 儀器 OLYMPUS-CX21FS1顯微鏡；GY-5000生物顯微鏡 （南京廣友光電儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器 （鄭州長城科工貿(mào)公司）；FA1004上皿電子天平 （上海精科儀器公司）；ZRS-8智能溶出實驗儀 （天津無線電廠）；101-2-S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海躍進醫(yī)療器械廠）；UV-2450紫外-可見分光度計 （日本島津儀器公司）；0.25μm微孔濾膜 （上海市新亞凈化器件廠）等。

1.2 材料 青蒿素原料 （鄭州荔諾生物制品有限公司，純度＞98%）；明膠 （化學(xué)純，中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑站，pH 5.5～7）；青蒿素對照品 （批號100202-200803，中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇 （分析純，上海申翔化學(xué)試劑有限公司）；液體石蠟、司盤-80、異丙醇等 （上海國藥試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 青蒿素微囊的制備方法 將含1%司盤-80的液體石蠟溶液在60℃下加熱并以一定轉(zhuǎn)速攪拌，作為制備青蒿素微囊的分散介質(zhì)，稱取適量的明膠溶解配制成設(shè)計濃度的明膠溶液，按試驗設(shè)計條件加入青蒿素粉末并充分攪拌均勻，將藥物的明膠溶液緩慢滴加入含1%司盤-80的液體石蠟溶液中，持續(xù)攪拌20 min，迅速冷卻至4℃以下，保持20 min，加50 mL異丙醇脫水，再加30 mL甲醛冰箱冷藏5 h固化，抽濾并以異丙醇洗滌多次除去殘留的甲醛，烘箱60℃充分干燥，備用。

2.2 青蒿素定量測定方法的建立［6］

2.2.1 標準曲線的繪制 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的青蒿素對照品10 mg，乙醇溶解定容于100mL量瓶中作為對照品貯備液備用。分別準確移取貯備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL置于50 m L量瓶中，加入一定量的乙醇補充至10 mL，用0.2%的氫氧化鈉溶液稀釋至刻度即得 2、4、8、12、16 μg/mL的青蒿素標準溶液，在 （50±1）℃恒溫水浴中放置30 min，取出以流水冷卻至室溫，以不含青蒿素的溶液為空白，用紫外分光光度計在292 nm處測定吸光度。以吸光度 （A）對質(zhì)量濃度（C）進行線性回歸，得青蒿素的標準曲線方程為A=0.045 4C+0.007 2（r2=0.999 4）。結(jié)果吸光度與質(zhì)量濃度在2～16μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗 精密移取貯備液5.0 m L于50 m L量瓶中，加入一定量的乙醇補充至10 m L，用 0.2%的氫氧化鈉溶液稀釋至刻度即得10 μg/mL的青蒿素溶液，在 （50±1）℃恒溫水浴中放置30 min，取出以流水冷卻至室溫，以不含青蒿素的溶液為空白，于1、2、4、8、12、24 h在292 nm處測定吸光度，RSD為1.77%，表明青蒿素溶液的吸光度相對穩(wěn)定。

2.2.3 精密度試驗 精密移取1.0、4.0、8.0 m L貯備液到50 mL量瓶中，加入一定量的乙醇補充至10 mL，用0.2%的氫氧化鈉溶液稀釋至刻度即得2、8、16μg/mL的青蒿素溶液，在 （50±1）℃恒溫水浴中放置30 min，取出以流水冷卻至室溫，5 d內(nèi)每天分別測定溶液吸光度一次，2、8、16 μg/mL的青蒿素溶液吸光度的RSD分別為2.61%、1.01%、0.57%，精密度結(jié)果良好。

2.2.4 加樣回收率試驗 精密移取1.0、4.0、8.0 mL貯備液到50 mL量瓶中，加入一定量的乙醇補充至10 mL，加入適量的明膠 （按最佳微囊制備條件的比例），用0.2%的氫氧化鈉溶液稀釋至刻度即得 2、8、16μg/m L的青蒿素溶液，在（50±1）℃恒溫水浴中放置30 min，取出以流水冷卻至室溫，過濾，取續(xù)濾液，在372 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算溶液中青蒿素量，平均回收率為100.9%，RSD為1.76%，符合要求。

2.3 青蒿素微囊包封率、載藥量及粒徑分布測定

2.3.1 青蒿素微囊包封率、載藥量測定 精密稱取青蒿素微囊適量，研磨破壞微囊結(jié)構(gòu)，以一定量乙醇60℃下水浴超聲溶解青蒿素，冷卻至室溫后乙醇定容到25 mL量瓶中，精密移取5 mL溶液于25 mL量瓶中，加入0.2%的氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，在（50±1）℃恒溫水浴中放置30 min。取出以流水冷卻至室溫，以不含青蒿素的溶液為空白，在292 nm處測定吸光度。代入 “2.2”項下的標準曲線計算青蒿素的濃度，并根據(jù)式 （1）、式 （2）分別計算青蒿素微囊的包封率、載藥量［7］。

2.3.2 青蒿素微囊外觀及粒徑分布測定［8］微囊的外觀形態(tài)采用光學(xué)顯微鏡觀察，采用軟件Scopephoto 3.0測量軟件計數(shù)500個微囊粒徑大小，統(tǒng)計粒徑分布情況。

2.4 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝 在單因素預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，確定影響微囊制備的主要因素為X1明膠濃度、X2囊心囊材比及X3攪拌速度，進行3因素5水平的星點設(shè)計，各因素水平代碼值及實際操作物理量值見表1；以Y1載藥量、Y2包封率、Y3微囊平均粒徑及 “歸一值”（OD值）來體現(xiàn)各指標的綜合效果，星點設(shè)計試驗結(jié)果見表2。

表1 星點設(shè)計因素水平Tab.1 Factors and levels for CCD

表2 星點設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Experiment results from CCD

觀察指標的歸一化處理采用Hassan方法，對于包封率、載藥量等要達到最大化的指標，計算公式如下：

dimax=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin） （3）

對于微囊的粒徑要達到最小化的指標，其計算公式如下：

dimin=（Ymax-Yi）/（Ymax-Ymin） （4）

根據(jù)公式 （1）和公式 （2）計算出各指標的di值后，由式 （5）計算OD值。

OD=（d1d2…dk）1/k（K為指標數(shù)） （5）

2.5 數(shù)據(jù)分析 以明膠濃度、囊心囊材比、攪拌速度為自變量，載藥量、包封率、微囊平均粒徑及綜合評價指標OD為因變量，采用Design-Expert 8.05軟件進行多元線性和二次多項式回歸，并以擬合優(yōu)度r2和置信度P作為模型判定標準，擬合方程結(jié)果見表3?？梢姴捎枚検椒匠虜M合的4個指標擬合效果均較多元線性方程好，OD值二項式擬合方程P=0.000 4，相關(guān)系數(shù)r2=0.908 8，顯示此擬合優(yōu)化模型具有統(tǒng)計學(xué)意義，有較大可信度。

表3 回歸方程擬合結(jié)果Tab.3 Equation fitting results

2.6 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測 3D效應(yīng)面圖只能表達含兩個因素變量的函數(shù)，故固定3個變量中的一個為中值，先代入方程，再以擬合的目標函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因變量效應(yīng)面圖。根據(jù)擬合方程，通過Design-Expert8.05軟件繪制評價指標OD值隨因素變化的效應(yīng)面圖（見圖1）。圖1顯示OD值隨明膠濃度的增大而逐漸減小，隨著囊心囊材比、攪拌速度的增大先逐漸增大后又減小。X1取值范圍在5.00%～6.03%，X2取值范圍在0.32～0.40，X3取值范圍在700～900時OD值可達到最大，通過Design-Expert 8.05軟件預(yù)測分析，獲得一組OD響應(yīng)值最大的優(yōu)化條件：X1=5.06%、X2=0.33、X3=751.62時，載藥量為 22.25%、包封率為89.31%，平均粒徑為69.91μm。

圖1 OD對X1X3,X2X3及X1X2預(yù)測效應(yīng)面Fig.1 Three-dimensional response surface of OD with X1X3,X2X3and X1X2

2.7 最優(yōu)工藝驗證試驗 根據(jù)最佳組方制備3批青蒿素微囊，進行驗證試驗，測定載藥量、包封率及平均粒徑，帶入OD的二次多項式方程計算OD值。結(jié)果見表4，最佳工藝條件的OD實測值與預(yù)測值間的偏差較小，表明本試驗建立的預(yù)測模型可以預(yù)測青蒿素微囊的制備工藝。

表4 最優(yōu)工藝驗證試驗結(jié)果Tab.4 Com parison of pred icted and measured

2.8 青蒿素微囊質(zhì)量評價

2.8.1 青蒿素微囊形態(tài)學(xué)考察 取青蒿素微囊少量置于白紙上，自然光下觀察呈灰色粉末狀；顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)見圖2，由圖可見青蒿素微囊外觀形態(tài)圓整，囊外游離藥物較少，粒徑均勻，平均粒徑為69.91μm。

圖2 微囊形態(tài)(10 x 40)Fig.2 M orphology of m icrocapsule(10 x 40)

2.8.2 青蒿素微囊體外釋藥性試驗 青蒿素微囊體外釋藥性試驗按 《中國藥典》2010年版溶出度測定法漿法進行，溶出溫度為 （37±0.5）℃，攪拌速度50 r/min，溶出介質(zhì)為1.5%SDS水溶液900 mL。精密稱取一定量的青蒿素微囊撒于溶出杯內(nèi)，分別于0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、 5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h取樣5 mL，并補充同體積1.5%SDS水溶液，取樣液經(jīng)微孔濾膜濾過，移取2 m L至10 mL量瓶中，加入含0.2%氫氧化鈉的25%無水乙醇溶液定容至刻度，在（50±1）℃恒溫水浴中放置30 min，取出以流水冷卻至室溫，以不含青蒿素的溶液為空白，紫外分光光度計在292 nm處測定吸光度，根據(jù) “2.2”項下的標準曲線回歸方程計算青蒿素質(zhì)量濃度，計算青蒿素微囊的累積釋放百分率 （見圖3）。

由青蒿素微囊體外累積釋放曲線可以看出，微囊在30 min的釋放量為25.8%，符合 《中國藥典》規(guī)定的微囊在開始0.5 h內(nèi)累計釋放百分率低于40%的要求。微囊在1 h后釋放開始減慢，12 h累積釋放百分率達到95%以上，與青蒿素原料藥相比微囊制劑有較好的緩釋作用。

圖3 體外累積釋放曲線Fig.3 Curve of in vitro release

2.9 青蒿素微囊體外釋藥模型擬合 對青蒿素微囊體外釋放曲線分別按零級、一級、Higuchi方程進行擬合，獲得擬合方程及相關(guān)系數(shù)r2（見表5）。相關(guān)系數(shù)r2的數(shù)值越大，表示釋藥模型越符合相應(yīng)的擬合方程，由表5得出青蒿素微囊體外釋藥按一級方程擬合最好，可以得出青蒿素微囊的體外釋藥行為更符合一級方程的描述，即恒速釋放。

表5 體外釋藥模型擬合結(jié)果Tab.5 Fitting resu lts for in vitro releasem odel

3 討論

目前，臨床上應(yīng)用的青蒿素制劑有口服片劑、直腸栓劑、靜脈注射劑及肌肉注射劑等，由于青蒿素在水中的溶解度小，在生物體內(nèi)的釋放度低，生物半衰期較短，導(dǎo)致生物利用度很低，需要頻繁給藥，給臨床治療帶來不利影響［9］，本研究制備的微囊制劑可降低青蒿素在生物體里的溶出速率，減少患者服藥次數(shù)，增加藥物在生物體內(nèi)的停留時間，提高青蒿素的生物利用度。

星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法通過描繪效應(yīng)對考察因素的效應(yīng)面，從效應(yīng)面上選擇較佳的效應(yīng)區(qū)，從而推出自變量取值范圍即最佳實驗條件，使用起來直觀、方便、效果較好。該方法較國內(nèi)常用的均勻設(shè)計和正交設(shè)計優(yōu)化法，實驗精度高，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性更好［10-11］。

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Optim izing preparation of artem isinin m icrocapsules by central com posite design and response surfacemethod

AIFeng-wei1， ZHUANG Hai-tao2， LING Yong3， TONG Lei4， WANG Jie1*
（1.School of Pharmacy，Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004，China；2.Pharmacy Department，Yishui Central Hospital of Linyi，Yishui276400，China；3.Pharmacy Department，The Hospital Affiliated to Qingdao University，Qingdao 266000，China；4.School of Pharmacy，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157000，China）

artemisinin microcapsules（AM）；central composite design（CCD）and response surfacemethod（RSD）；encapsulation efficiency

R944

：A

：1001-1528（2015）07-1457-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.014

2014-08-17

徐州市科技計劃項目 （KC14SH077，XM12B017）

艾鳳偉 （1983—），男，實驗師，主要從事藥物新劑型研究。Tel：（0516）83262141，E-mail：afew2012@163.com

*通信作者：王 杰（1972—），男，高級實驗師，主要從事中藥藥理學(xué)研究。Tel：（0516）83262141，E-mail：wangjie@xzmc.edu.cn