王建筑， 王欣欣， 畢研平， 李 菲， 郝吉福

（山東泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016）

丹皮酚非離子型類脂囊泡的制備

王建筑， 王欣欣， 畢研平， 李 菲， 郝吉福

（山東泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016）

目的制備丹皮酚非離子型類脂囊泡，并考察其體外釋放度。方法采用薄膜分散-超聲法制備丹皮酚非離子型類脂囊泡，以包封率為指標，采用單因素考察法優(yōu)選丹皮酚類脂囊泡的處方組成和制備工藝，并進行體外釋放度考察。結(jié)果采用司盤-60∶膽固醇 （1∶1）為囊材，藥脂比例為1∶10，40℃條件下水合60min，以頻率400 Hz超聲5 min，可制得丹皮酚非離子型類脂囊泡，包封率平均為78.4%，其體外釋放過程與丹皮酚溶液相比較具有明顯緩釋作用。結(jié)論該方法適合于制備丹皮酚非離子型類脂囊泡。

丹皮酚；類脂囊泡；薄膜分散-超聲法；體外釋放。

丹皮酚 （paeonol）又名牡丹酚，是中藥牡丹皮和徐長卿的主要活性成分，具有祛風(fēng)、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過敏、活血、抗病毒和抑制變態(tài)反應(yīng)等藥理作用［1-4］，能夠抑制細胞內(nèi)O2-自由基的產(chǎn)生，使皮膚中色素還原退色，消瘀化斑，對色斑、肌肉痛、皮膚瘙癢、牛皮癬、帶狀皰疹、濕疹具有較好的防治效果［4-5］。除此之外，還具有較強的抗癌活性。它能通過影響腫瘤細胞基因表達等機制抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡，對腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷作用。目前對于丹皮酚的制劑研究大多以載體的形式進行包裹，如脂質(zhì)體，微囊，微球，自微乳等［6-9］。

非離子表面活性劑囊泡（Non-ionic surfactant based vesicles，簡稱niosomes），又稱類脂囊泡，是非離子型表面活性劑和膽固醇在親水介質(zhì)中能夠自組裝形成的具有閉合雙分子層膜結(jié)構(gòu)的封閉體系［10-13］，其結(jié)構(gòu)類似于脂質(zhì)體，但制備類脂囊泡時的材料中不含磷脂，可以避免磷脂在使用貯存中的的氧化降解，且類脂囊泡兼具有脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的緩釋、高效、低毒及良好的生物相容性和可降解性，

可根據(jù)實際用途設(shè)計其結(jié)構(gòu)，因此類脂囊泡技術(shù)已經(jīng)成為化學(xué)、藥學(xué)和生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的熱點之一［14-16］。本研究將丹皮酚制成非離子型類脂囊泡，可將不溶于水的且穩(wěn)定性差的丹皮酚包裹于其中，考察類脂囊泡對丹皮酚的包封作用及其體外釋放作用的影響。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 S-54紫外分光光度計 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）；SIGMA 3K30型超速冷凍離心機；超聲波細胞粉碎機 （寧波新芝生物科技股份有限公司）；MD34型透析袋 （截留分子質(zhì)量8 000～14 000）。

1.2 材料和試劑 丹皮酚 （泰安中薈植物生化有限公司）；司盤-20（Span20）；司盤-40（Span40）；司盤-60（Span60）；司盤-80（Span80）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；膽固醇 （上海長城生化制藥廠）；其余所用試劑均為分析純 （市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 包封率的測定

2.1.1 丹皮酚標準曲線的制備 精確稱取適量丹皮酚用適量甲醇溶解后制成質(zhì)量濃度為20μg/mL的貯備液。精密量取上述貯備液適量，分別加甲醇稀釋成1、2、4、6、8μg/m L的丹皮酚溶液。以甲醇為空白對照，于波長275 nm處測定各溶液的吸光度，以吸光度A為縱坐標，丹皮酚質(zhì)量濃度C（μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得線性回歸方程為A=89.707C+0.009 8（r=0.999 9，n=5），結(jié)果表明，丹皮酚在1～8μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

2.1.2 精密度試驗 取同一份丹皮酚類脂囊泡，照 “2.1.4”項下方法測定包封率，共測5次，計算日內(nèi)精密度RSD為0.9% （n=5）。另取一份丹皮酚類脂囊泡，連續(xù)5 d，每天在同一時間測定包封率，計算日間精密度RSD為1.7% （n=5），表明本方法精密度良好。

2.1.3 回收率試驗 精密量取質(zhì)量濃度為6 μg/mL的對照品溶液2、4、6 mL，各置于10mL量瓶中，分別加入空白類脂囊泡2 m L，用甲醇定容至刻度，搖勻，進樣測定峰面積。結(jié)果表明，丹皮酚的平均回收率為97.36%，RSD為2.34%（n=3）。

2.1.4 包封率測定方法 取制備好的丹皮酚類脂囊泡液搖勻，精密量取0.1 mL，適當稀釋后加甲醇破乳溶解，高速離心后測定類脂囊泡中總的藥物量m總。

取制備好囊泡混懸液1.0 mL置于離心管中，以轉(zhuǎn)速20 000 r/min高速離心15 min，取其上清液，用甲醇稀釋后，測吸光度A，計算游離藥物的量m游。

包封率：EE=［（m總-m游）/m總］×100%

2.2 丹皮酚非離子型類脂囊泡的制備和優(yōu)化

2.2.1 丹皮酚類脂囊泡的制備 采用薄膜分散-超聲法制備丹皮酚類脂囊泡。首先稱取處方量的囊泡載體材料 （司盤、膽固醇）和藥物丹皮酚，加入適量二氯甲烷使其溶解，然后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃減壓蒸發(fā)至于瓶壁形成均勻薄膜為止，向燒瓶中加入適量pH 7.4磷酸鹽緩沖液，控溫并攪拌水合一定時間形成混懸液，然后將此混懸液冰浴下探頭超聲使之分散均勻，并依次通過 0.80、0.45μm微孔濾膜即得丹皮酚類脂囊泡。

2.2.2 囊材篩選 按“2.2.1”項下方法制備丹皮酚類脂囊泡時，囊泡材料 （司盤-膽固醇為1∶1）總質(zhì)量濃度為10 mg/m L，加入藥物質(zhì)量濃度為1 mg/m L，40℃下加入磷酸鹽緩沖液水合30 min，完成后采用300 W探頭超聲10 min，考察不同種類司盤作為囊材時對載藥類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果見表1，以Span60制備的囊泡包封率最高，且制備的囊泡外觀呈均一且有藍色乳光的混懸液，所以選擇Span60作為囊材進行下一步研究。

表1 司盤種類對丹皮酚類脂囊泡包封率的影響Tab.1 Effect of SpanX on the entrapment efficiency of paeonol niosom es

2.2.3 Span60與膽固醇比例的選擇 改變類脂囊泡載體材料Span60與膽固醇比例 （3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3），以藥脂比為1∶5采用相同的制備工藝制備囊泡，考察不同的囊材比例對載藥類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果見表2，當Span60∶膽固醇為1∶1時，囊泡的包封率較高，所以確定處方中囊材與膽固醇比例1∶1。

表2 司盤60和膽固醇比例對丹皮酚類脂囊泡包封率的影響Tab.2 Effect of Span60—cholesterol ratio on the entrapment efficiency of paeonol niosomes

2.2.4 類脂囊泡藥脂比例對包封率的影響：分別采用不同的藥脂比例 （1∶5、1∶10、1∶20、1∶40），以相同的制備工藝制備類脂囊泡，考察藥脂比例的變化對丹皮酚類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果見表3，當藥脂比例1∶10時，囊泡的包封率最佳。

表3 不同藥脂比例對丹皮酚類脂囊泡包封率的影響Tab.3 Effect of drug-lipid ratio on the entrapment efficiency of paeonol niosomes

2.2.5 水合時間的確定 采用上述優(yōu)化的處方組成制備丹皮酚類脂囊泡，加入水合介質(zhì)后，40℃水浴下分別考察不同的水合時間 （30、60、90 min）對載藥類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果包封率分別為63.6%、70.3%、71.0%，表明水合時間越長，包封率越高，但水合時間超過60 min后，時間延長對包封率影響不明顯，故確定水合時間為60 min。

2.2.6 水合溫度的確定 以優(yōu)化的處方組成制備載藥類脂囊泡，加入水合介質(zhì)后，分別以不同的水合溫度 （30、40、50℃）水合60 min，考察水合溫度對載藥類脂囊泡包封率的影響，結(jié)果包封率分別為65.2%、71.5%、71.7%，因此，確定最終水合溫度為40℃。

2.2.7 超聲工藝的影響 制備載藥類脂囊泡水合過程完成后，分別采用不同功率進行探頭超聲不同時間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：超聲過程中超聲功率和超聲時間對載藥類脂囊泡包封率無顯著影響，可能超聲過程改變的只是類脂囊泡的粒徑，因此確定超聲工藝為以400 W的功率探頭超聲5 min。

2.3 處方驗證 通過以上考察最終確定丹皮酚類脂囊泡處方組成和制備工藝為以Span60-膽固醇（比例為1∶1）為囊材，藥脂比例1∶10，加入磷酸鹽緩沖液以40℃水合60 min，完成后以400 W的功率探頭超聲5 min，平行制備3次，結(jié)果表明得到的丹皮酚類脂囊泡為帶有藍色乳光均一的白色混懸液，平均包封率為76.9%，RSD為3.3%。

2.4 顯微觀察形態(tài) 將制備好的類脂囊泡 （未經(jīng)微孔濾膜過濾和超聲處理）置于顯微鏡下觀察，由圖1可見，囊泡外觀呈完整圓形或橢圓形。

圖1 丹皮酚類脂囊泡的顯微形態(tài) (x 400)Fig.1 M icro-morphology of paeonol niosomes(x400)

2.5 丹皮酚類脂囊泡的體外釋放度測定 分別精密吸取丹皮酚溶液（0.1 mg丹皮酚溶解在10 m L甲醇中）和丹皮酚類脂囊泡各0.5 mL置面積大小相同的透析袋中，并將其固定于溶出儀的攪拌漿上，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液200 m L為釋放介質(zhì)，在 （37±0.5）℃的恒溫下進行體外釋放性能測定 （轉(zhuǎn)速50 r/min）。分別于不同時間點取樣為2 mL，同時補充等量同溫的釋放介質(zhì)，樣品經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾后，取體外釋放試驗所得的樣品溶液，以甲醇為空白在274 nm出測定吸光度。計算其中丹皮酚的濃度，并計算體外釋放度，其體外釋放曲線見圖2。

圖2 丹皮酚類脂囊泡體外釋放曲線Fig.2 Cu rves for paeonol niosom es in vitro release

由圖2可以看出，溶液在1 h時釋放即達50%以上，5 h時釋放度即接近100%，而類脂囊泡1 h時只有 30%左右的釋放，18 h時釋放度接近100%，因此類脂囊泡明顯具有緩釋作用，且釋藥機制符合Higuchi方程。

3 討論

制備非離子型類脂囊泡常用的囊材有司盤、吐溫、賣澤及卞澤。由于丹皮酚為脂溶性藥物，所以本實驗采用脂溶性的司盤作為囊材，以期取得到較高的包封率。

非離子表面活性劑囊泡的制備方法主要有注入法、薄膜分散法、超聲分散法、高壓乳化法和反向蒸發(fā)法。其中注入法制得的囊泡粒徑較大，高壓乳化法和反向蒸發(fā)法適用于水溶性藥物，而丹皮酚為脂溶性的藥物，所以本實驗采用薄膜分散法制備類脂囊泡，且該法制得的囊泡粒徑較小且均勻。

如果制備過程中用span-60，水合溫度應(yīng)保持在span-60的相變溫度 （53℃）以上，低于此溫度則形成的非離子囊泡膜流動性較大，導(dǎo)致包封率降低。由于丹皮酚的熔點在50℃左右，所以水合溫度不宜高于53℃，否則包封率比較低。類脂囊泡的結(jié)構(gòu)與脂質(zhì)體類似，成囊時需有表面活性劑和穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)的膽固醇。

在測定類脂囊泡包封率時，首先需要將包封的藥物與游離藥物進行分離，分離方法的優(yōu)劣直接影響到包封率的測定結(jié)果。本實驗中采用的是高速離心法。首先精密量取丹皮酚甲醇溶液適量，加至空白囊泡中，分別取該溶液1.5 mL，按20 000 r/min高速離心15min，平行做5份，測定上清液中丹皮酚的藥物含有量，計算回收率。結(jié)果表明，丹皮酚-空白囊泡混合液通過高速離心法分離，加入的丹皮酚回收率均在95%以上，表明空白囊泡對游離丹皮酚基本無吸附。此法可以用于類脂囊泡混懸液中游離藥物的分離。

本實驗采用薄膜分散法制備丹皮酚非離子型類脂囊泡，以包封率為指標篩選，經(jīng)優(yōu)化后的處方組成和制備工藝制備得丹皮酚類脂囊泡包封率為76.9%，體外釋放度實驗表明丹皮酚經(jīng)類脂囊泡包裹后，具有明顯的緩釋作用。并且利用非離子表面活性劑囊泡包裹藥物可以減少藥物在達到有效部位前被破壞、延長藥物的中半衰期、從而延長藥物的作用時間以及降低毒副作用的特點。

［1］胡春弟，張 杰.丹皮酚的藥理及合成研究進展［J］.化學(xué)與生物工程，2009，26（8）：16-18.

［2］劉愛敏，武海軍，楊玉梅.丹皮酚的鎮(zhèn)痛作用［J］.包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，20（2）：99-100.

［3］劉春云，武廷章.鳳丹丹皮酚抗菌作用的研究［J］.生物學(xué)雜志，2000，17（3）：23-24.

［4］邢國勝，房德敏，周詠梅.丹皮酚的制備及藥理作用研究進展［J］.中草藥，2006，37（11）：附2-7.

［5］解士海，陳志強.丹皮酚在體外對人黑素細胞酪氨酸酶活性及黑色素生成的影響［J］.中華皮膚科學(xué)雜志，2006，39（11）：639-641.

［6］賈獻慧，唐文照，閆 軍.丹皮酚脂質(zhì)體的研制及其體外釋放研究［J］.中成藥，2011，33（2）：255-258.

［7］姜素芳，州艷琴.丹皮酚微囊的制備及質(zhì)量評價［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（21）：1872-1874.

［8］姜素芳，張雪萍，周學(xué)軍.丹皮酚的自微乳的制備與評價［J］.中成藥，2012，34（5）：835-838.

［9］張海龍.丹皮酚聚乳酸羥基乙酸微球的制備及體外釋藥考察［J］.中國藥房，2013，24（19）：1765-1767.

［10］Ning Meiying，Guo Yingzhi，Pan Huaizhong，et al.Niosomes with sorbitan monoester as a carrier for vaginal delivery of insulin：studies in rats［J］.Drug Delivery，2006，12（6）：399-407.

［11］Vyas S P，Singh R P，Jain S，et al.Non-ionic surfactant based vesicles（niosomes）for non-invasive topical genetic immunization against hepatitis B［J］.Int J Pharm，2005，296（1-2）：80-86.

［12］李靜雅，苗鳳茹，朱 丹，等.馬錢子總堿囊泡凝膠經(jīng)皮給藥后在大鼠組織中的分布研究［J］.中草藥，2012，43（2）：327-331.

［13］胡 杰，吳珍珍，胡克菲，等.馬錢子總堿囊泡的制備與評價［J］.中國中藥雜志，2011，36（14）：1955-1998.

［14］廖正根，韓錫鎮(zhèn)，李 翔，等.三七總皂苷符合納米囊泡的理化性質(zhì)及對大鼠心肌缺血的保護作用［J］.中國藥學(xué)雜志，2013，48（6）：899-903.

［15］劉 丹，胡海洋，陳大為，等.芹菜素囊泡的制備及理化性質(zhì)考察［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2009，26（6）：423-427.

［16］陳洪軒，徐志杰，肖衍宇.蛇床子素非離子囊泡的制備和質(zhì)量評價［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42（1）：33-37.

Preparation of paeonol niosomes

WANG Jian-zhu， WANG Xin-xin， BIYan-ping， LIFei， HAO Ji-fu
（Department of Pharmacology，Taishan Medical College，Taian 271016，China）

paeonol；niosomes；film ultrasonic dispersion；in-vitro release

R969.1

：A

：1001-1528（2015）07-1467-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.016

2014-08-18

泰安市科技發(fā)展計劃 （201440774-16）

王建筑（1981—），男，碩士，講師，研究方向為藥物新劑型與新技術(shù)。Tel：13668681261，E-mail：jzwang@tsmc.edu.cn