王甫成， 時維靜， 龔道鋒， 程 磊， 紀(jì)東漢

（1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所，亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州236800；2.安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽233100）

亳菊和大馬牙中綠原酸、黃酮類成分及揮發(fā)油含有量的比較

王甫成1， 時維靜2， 龔道鋒1， 程 磊1， 紀(jì)東漢1

（1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所，亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州236800；2.安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽233100）

目的建立HPLC法同時測定亳菊和大馬牙中綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素，為選用藥用菊花提供參考。方法2種菊花以70%甲醇提取，HPLC分析采用Shim-pack C18柱（4.6 mm×250mm，5μm），流動相為乙腈 （A相）-0.1%磷酸 （B相）梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長348 nm；按 《中國藥典》方法測定它們的總揮發(fā)油含有量。結(jié)果綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素分別在0.5～5.0μg、0.11～1.1μg、0.74～7.4μg、0.39～3.9μg、0.28～2.8μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為99.3%（RSD=2.0%）、99.3%（RSD=2.0%）、99.7%（RSD=1.9%）、99.1%（RSD=2.0%）、98.0%（RSD=1.8%）。亳菊揮發(fā)油提取率為0.52%，大馬牙為0.42%。亳菊中的綠原酸、木犀草苷、槲皮素、金合歡素和總揮發(fā)油含有量高于大馬牙，但大馬牙的黃芩苷含有量高于亳菊4倍多。結(jié)論大馬牙中綠原酸和木犀草苷含有量未能在線性范圍內(nèi)測得，所以不能代替亳菊入藥。

亳菊；大馬牙；綠原酸；木犀草苷；黃芩苷；槲皮素；金合歡素；揮發(fā)油

菊花（Chrysanthemi Flos）為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium（Ramat.）的干燥頭狀花序，味甘、苦，微寒；歸肺、肝經(jīng)；具有散風(fēng)清熱，平肝明目，清熱解毒之功效；可用于風(fēng)熱感冒，頭痛眩暈，目赤腫痛，眼目昏花，瘡癰腫毒等［1］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，稱 “久服利氣血，輕身耐老延年”，是我國傳統(tǒng)常用中藥材，藥食兩用，應(yīng)用廣泛。菊花中綠原酸具有明顯的抗菌、抗腫瘤和保護心血管的活性［2］；木犀草苷具有降血脂、降壓及免疫雙向調(diào)節(jié)等作用［3］；槲皮素具有抗氧化及清除自由基和抗炎、抗菌、抗病毒及心血管保護等作用［4］；金合歡素具有抗AIDS的作用［5］，同時可作用于人的肝癌細(xì)胞系的增殖階段G2，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋零，促成細(xì)胞周期的停滯［6］。木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素都是黃酮類成分，菊花總黃酮具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用［7］。

安徽亳州是菊花的重要產(chǎn)區(qū)，種植的品種有亳菊、大馬牙、小白菊和杭白菊等。小白菊和杭白菊常作為飲品應(yīng)用，作為藥用入藥的亳菊近年來資源越來越少，瀕臨枯竭，究其原因是亳州當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)因大馬牙菊花花大、產(chǎn)量高而棄種亳菊改種大馬牙，用大馬牙來充當(dāng)亳菊來用。為引導(dǎo)藥農(nóng)種植正宗亳菊，王德群等［8］從產(chǎn)地調(diào)查、栽培觀察和標(biāo)本研究等方面，對亳菊和大馬牙2個品種菊花進行了詳實比較分析，指明2種菊花是不同品種菊花，在種植和用藥過程中不能混淆。本實驗采用HPLC法考察亳菊和大馬牙中綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素5種成分，并對其總揮發(fā)油含有量進行比較，探究亳菊和大馬牙2種菊花內(nèi)在成分及質(zhì)量的差異，從多成分角度分析大馬牙不能簡單替代亳菊入藥，為藥用菊花亳菊質(zhì)量評價與科學(xué)選用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT型分析半制備高效液相色譜儀 （日本島津公司）、AF240型電子分析天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 綠原酸對照品 （110753-200908）、木犀草苷對照品 （111720-200806）、黃芩苷（110715-201003）、槲 皮 素 對照品 （100081-201005）購自中國藥品生物制品檢定所，金合歡素對照品由安徽科技學(xué)院時維靜教授提供。乙腈、磷酸、甲醇均為色譜純，水為娃哈哈純凈水。

實驗所用亳菊和大馬牙藥材采收于安徽省亳州市譙東藥用植物園、亳州市魏崗鎮(zhèn)菊花種植基地和安徽中醫(yī)藥科學(xué)院亳州中醫(yī)藥研究所藥用植物園，由安徽科技學(xué)院時維靜教授鑒定，分別為亳菊Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel.‘Boju' cv.nov.、大馬牙Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel.‘Da maya'cv.nov.的干燥頭狀花序。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shim-pack C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5μm）；以乙腈 （A相）-0.1%磷酸水溶液（B相）梯度洗脫（0～11 min，10%～18%A；11～30 min，18%～20%A；30～40 min，20%～30%A；40～50 min，30%～40%A；50～60 min，40%～42%A；60～65 min，42%A；65～75 min，42%～60%A；75～85 min，60%～70%A）。體積流量1.0 mL/min；檢測波長348 nm，柱溫30℃；進樣量10μL。

2.2 樣品制備

2.2.1 對照品溶液的配制 分別取綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶解并制成每1 mL含綠原酸2.500 mg、木犀草苷0.550 mg、黃芩苷3.700 mg、槲皮素1.950 mg、金合歡素1.400 mg的對照品貯備液。再精密量取以上對照品貯備液各1 mL置于10 mL量瓶中，加70%甲醇制成每1 mL含綠原酸0.250 0 mg、木犀草苷0.055 0 mg、黃芩苷0.370 0 mg、槲皮素0.195 0 mg、金合歡素0.140 0 mg的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別精密稱取亳菊、大馬牙2種菊花樣品粗粉 （過40目篩）2 g置具塞錐形瓶中，加入70%甲醇50 m L，密塞后稱定質(zhì)量，常溫下超聲提取 （功率300W，頻率45 kHz）40 min，放置冷卻后再次稱定質(zhì)量，并用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得供試品。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 精密吸取上述混合對照品溶液、供試品溶液各10μL，按 “2.1”項下色譜條件進行分析，記錄色譜圖，結(jié)果顯示綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素得到很好分離，與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，混合對照品和樣品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A)、供試品亳菊 (B)、大馬牙 (C) HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of m ixed reference substances(A),Boju sam p les(B),and Da maya sam p les(C)

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液，依次按2、6、8、12、16、20μL分別進樣，按“2.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，混合對照品進樣量 （μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行線性回歸方程計算。各成分的線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 5種成分的線性關(guān)系、回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.1 Linear ranges and regression equations of five constituen ts

2.3.3 精密度試驗 取綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素混合對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進6次樣，分別計算峰面積RSD。結(jié)果綠原酸峰面積RSD為1.7% （n=6）、木犀草苷峰面積RSD為1.0%（n=6）、黃芩苷峰面積RSD為1.9%（n=6）、槲皮素峰面積RSD為1.8%（n= 6）和金合歡素峰面積RSD為1.4% （n=6），結(jié)果表明精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取同一批亳菊藥材樣品，共6份，按供試品制備方法制備平行供試品溶液，按上述色譜條件分別進行測定。結(jié)果亳菊藥材樣品中綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.403 0%、0.051 5%、0.212 0%、0.403 0%、0.291 0%，RSD分別為1.9% （n=6）、1.4% （n=6）、1.6% （n=6）、1.7% （n=6）、1.4% （n=6），表明本測定方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取 “2.2.2”項下供試品溶液，分別在0、3、6、8、12、24 h測定，進樣量為10μL，分別計算綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素的峰面積RSD。結(jié)果綠原酸峰面積RSD為1.4%（n=6）、木犀草苷峰面積RSD為1.1% （n=6）、黃芩苷峰面積RSD為1.5%（n=6）、槲皮素峰面積RSD為1.0% （n=6）和金合歡素峰面積RSD為1.3% （n=6），結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 回收率試驗 取已知各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù) （綠原酸0.402 0%、木犀草苷0.051 0%、黃芩苷0.212 0%、槲皮素0.404 0%、金合歡素0.290 0%）的亳菊藥材樣品粗粉 （過40目篩）6份，各約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入綠原酸對照品貯備液3.20 m L、木犀草苷對照品貯備液1.90 mL、黃芩苷對照品貯備液1.10 mL、槲皮素對照品貯備液4.20 mL、金合歡素對照品貯備液4.20mL，甲醇補足至50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按 “2.1”項下條件進行測定，計算綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素加樣平均回收率和RSD，見表2，結(jié)果表明，本方法回收率良好。

表2 菊花中5種成分加樣回收實驗結(jié)果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests for five constituents in Ch rysanthem i F los(n=6)

2.4 樣品測定 分別取采自亳州3個不同種植地的亳菊和大馬牙菊花藥材樣品各3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按 “2.1”項下條件進行HPLC分析測定，分別進樣10μL，記錄峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素的含有量，結(jié)果見表3。

表3 樣品的測定結(jié)果(n=9)Tab.3 Determ ination resu lts of sam p les(n=9)

2.5 揮發(fā)油的測定 分別取采自亳州3個不同種植地的亳菊和大馬牙菊花藥材樣品各50 g，按照《中國藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油測定法的甲法操作［1］，測得樣品中揮發(fā)油的含有量，結(jié)果見表4。

表4 揮發(fā)油測定結(jié)果Tab.4 Results of volatile oil conten t determ ination

3 討論

參考相關(guān)文獻［9］，在200～400 nm掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素4種成分在348 nm處有較高的吸收，干擾少且峰好，因此檢測波長選取348 nm進行測定。

按照 《中國藥典》2010年版菊花項下流動相梯度洗脫，槲皮素、金合歡素峰重疊，分離不開。參考有關(guān)文獻［10-12］，綜合綠原酸、木犀草苷、黃芩苷、槲皮素和金合歡素5種成分的結(jié)構(gòu)特點，需要在30 min后進一步細(xì)化流動相梯度，才能將槲皮素、金合歡素分開，經(jīng)變換梯度，反復(fù)摸索，獲得分離效果最佳的流動相梯度。

亳菊和大馬牙兩個品種菊花在安徽亳州都有種植，近年來，因亳菊產(chǎn)量不高而大馬牙花大、產(chǎn)量高，當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)追求經(jīng)濟效益棄種亳菊而大量種植大馬牙這一品種菊花，導(dǎo)致亳菊藥材瀕臨枯竭，影響到藥用菊花臨床選用。王德群［8］從花頭狀花序形狀、大小、總包層數(shù)，舌狀花的顏色、層數(shù)、內(nèi)外層的長度，管狀花數(shù)量、顏色等方面將亳菊和大馬牙兩種菊花做了細(xì)致比較鑒別，指出了2種菊花品種的差異。對單一菊花或不同產(chǎn)地菊花多成分比較分析有報道［13-15］，但就亳菊及其偽品大馬牙內(nèi)在5種成分及其總揮發(fā)油含有量比較分析未見報道。通過實驗測得數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)亳菊中綠原酸、木犀草苷、槲皮素和金合歡素含有量均高于大馬牙，大馬牙中綠原酸和木犀草苷含有量很低在線性范圍內(nèi)未測得，但大馬牙中黃芩苷含有量達0.905%，比亳菊高出4倍多。毫菊總揮發(fā)油提取率高于大馬牙。通過數(shù)據(jù)比較分析可得出，2種菊花內(nèi)在成分及含有量存在一定差異，不能簡單用大馬牙偽充亳菊入藥。

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Com parison of chlorogenic acid，flavonoids and volatile oils between Boju and Da maya

WANG Fu-cheng1， SHIWei-jing2， GONG Dao-feng1， CHENG Lei1， JIDong-han1
（1.Bozhou Institute of Chinese Materia Medica，Anhui Academy of Chinese Medicine，Bozhou Vocational and Technical College，Bozhou 236800，China；2.Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China）

AIMTo establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of chlorogenic acid，galuteolin，baicalin，quercetin and acacetin in Dendranthema morifolium（Ramat.）Tzvel.‘Boju'cv. nov.and D.morifolium（Ramat.）Tzvel.‘Da maya'cv.nov.formedicinal choice.METHODSThe analysis of chlorogenic acid and flavonoidswas carried out on Shim-pack C18（4.6 mm×250 mm，5μm）.Themobile phase consisted ofwater contained acetonitrile（A）and 0.1%phosphoric acid aqueous solution（B）in a gradient elution manner.The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 30℃，and the detection wavelength was set at348 nm.The total content of volatile oil wasmeasured.RESULTSThe linear relationships of chlorogenic acid，galuteolin，baicalin，quercetin and acacetin were in the ranges of 0.5-5.0μg，0.11-1.1μg，0.74-7.4μg，0.39-3.9μg，and 0.28-2.8μg，respectively.Their average recovery rates were 99.3%（RSD=2.0%），99.3%（RSD=2.0%），99.7%（RSD=1.9%），99.1%（RSD=2.0%），and 98.0%（RSD=1.8%），respectively.Their volatile oil yields were 0.52%and 0.42%，respectively.The contents of chlorogenic acid，galuteolin，quercetin，acacetin and volatile oil in Boju were higher than that of Da maya.The baicalin content in Da maya was higher than that of Boju.CONCLUSIONDa maya contains so low contents ofchlorogenic acid and galuteolin that it can not take the place of Boju in clinic use.

Dendranthemamorifolium（Ramat.）Tzvel.‘Boju'cv.nov.；Dendranthemamorifolium（Ramat.）Tzvel.‘Da maya'cv.nov；chlorogenic acid；galuteolin；baicalin；quercetin；acacetin；volatile oil

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1534-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.030

2015-01-16

安徽省高等教育振興計劃人才項目 （皖教秘人 ［2014］181號）；安徽省高等學(xué)校省級質(zhì)量工程項目 （2014jxtd073，2013sxzx035）；安徽省省級專業(yè)帶頭人資助項目 （皖教秘人 ［2011］2號）；安徽省高校省級自然科學(xué)研究項目 （KJ2010B418）

王甫成 （1979—），男，副教授，碩士，主要從事中藥加工炮制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel：（0558）5587026，E-mail：wfc520@ 126.com