輕曼古麗·阿吉， 馬 虎， 美合熱阿依·伊薩克， 周文婷， 依麗孜拉·阿不都沙拉木，

古麗迪亞爾·伊斯坎代爾1， 艾尼瓦爾·吾買爾1*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，新疆烏魯木齊830011；2.博州人民醫(yī)院藥劑科，新疆 博樂(lè)市833400）

榅桲總黃酮對(duì)血栓形成和血小板聚集作用的影響

輕曼古麗·阿吉1，2， 馬 虎1， 美合熱阿依·伊薩克1， 周文婷1， 依麗孜拉·阿不都沙拉木1，

古麗迪亞爾·伊斯坎代爾1， 艾尼瓦爾·吾買爾1*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，新疆烏魯木齊830011；2.博州人民醫(yī)院藥劑科，新疆 博樂(lè)市833400）

目的研究榅桲總黃酮對(duì)大鼠血栓形成及血小板聚集功能的影響。方法采用膠原蛋白-腎上腺素混合物誘導(dǎo)小鼠肺血栓模型、大鼠動(dòng)-靜脈旁路血栓形成模型、體外對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的兔血小板聚集作用的影響，觀察榅桲總黃酮的抗血栓形成作用。結(jié)果榅桲總黃酮能明顯提高膠原蛋白-腎上腺素混合物誘導(dǎo)小鼠的存活率；榅桲總黃酮能明顯減輕動(dòng)-靜脈旁路血栓濕質(zhì)量，降低血漿中血栓素B2（TXB2）的水平和增加血漿中6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）的水平；可抑制不同時(shí)間點(diǎn)由凝血酶誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的家兔血小板聚集。結(jié)論榅桲總黃酮有抗血栓形成作用，并具有抗凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集作用。

榅桲總黃酮；血小板聚集；動(dòng)-靜脈旁路血栓模型；血栓素B2；6-酮前列腺素-F1α

榅桲為薔薇科榅桲屬植物榅桲Cydonia oblonga Mill.的成熟果實(shí)。榅桲呈梨形，外皮黃棕色或暗紅色，皺縮不平，肉厚而粗，切面呈小顆粒狀，邊緣不卷曲。氣芳香，味酸甜［1］。其成熟果實(shí)可補(bǔ)腦益心，增益精神力，助胃利水，止渴止咳，用于頭暈心慌，神疲乏力，食少胃弱，瀉痢咳喘，咯血嘔惡，口渴尿閉。

目前對(duì)榅桲的化學(xué)成分研究較多見(jiàn)，而藥理作用只見(jiàn)榅桲提取物具有明顯的抑制動(dòng)脈血栓形成，抗凝血和纖溶作用［2］和降血壓、調(diào)血脂［3］方面的研究。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究榅桲總黃酮抗血栓形成作用。

1 材料

1.1 榅桲果實(shí)總黃酮和榅桲葉總黃酮制備［4］榅桲果實(shí)和葉采自新疆葉城縣，置于陰涼通風(fēng)干燥處干燥，榅桲由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)/生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿不力孜教授鑒定為薔薇科榅桲屬植物Cydonia oblonga Mill.的葉和果實(shí)。被粉碎成粉末后，用30倍60%乙醇在60℃超聲提取3次，每次40 min，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇得到榅桲總黃酮浸膏備用。榅桲總黃酮浸膏用大孔樹(shù)脂進(jìn)一步富集純化，得到榅桲總黃酮，按蘆丁計(jì)算榅桲總黃酮含有量均大于60%。

1.2 動(dòng)物 小白鼠，雌雄各半，128只，體質(zhì)量18～22 g，清潔級(jí)；均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（新）2011-0004；SD大鼠，雌雄各半，64只，體質(zhì)量300～350 g，清潔級(jí)；均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（新）2011-0004。

1.3 試劑 阿司匹林（Sigma-Aldrich Chimie Sarl公司，批號(hào)081M0194V），烏拉坦 （上海三浦化工有限公司，批號(hào)20060418），血栓素B2放射免疫分析藥盒 （北京北方生物研究所，批號(hào)130620），6-酮-前列腺素放射免疫分析藥盒（北京北方生物研究所，批號(hào)130620），凝血酶 Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

1.4 儀器 490-4D型血小板聚集儀（美國(guó)CHRONO-LOG公司），BC-2300準(zhǔn)全自動(dòng)三分群血液細(xì)胞分析儀 （深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），GC-2016γ放射免疫計(jì)數(shù)器 （安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠），SH8210HP超聲儀 （上?？茖?dǎo)儀器廠），BL1500電子天平 （北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），TDL-5A離心機(jī) （上海菲恰爾分析儀器有限公司），分析天平 （梅特勒托利多儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 榅桲總黃酮對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的家兔血小板聚集的影響

2.1.1 富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）和貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）的制備［5-6］自清醒家兔頸動(dòng)脈取血，以3.8%枸櫞酸鈉 （9∶1）抗凝收集于離心管中，在室溫條件下，1 000 r/min離心10 min，上層液即為PRP。剩余血液再以3 000 r/min離心15 min，上層液即為PPP，作為測(cè)定時(shí)調(diào)零或用于調(diào)整PRP中的血小板數(shù)。PRP呈乳白色，PPP呈清亮透明的淡黃色。本實(shí)驗(yàn)血小板數(shù)控制在2.0×1011個(gè)/L（做預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的）。

2.1.2 血小板聚集性測(cè)定 按Born氏比濁法原理采用血小板聚集儀進(jìn)行測(cè)定。分別取PPP及PRP各270μL于比濁管中，置于預(yù)熱孔；于PRP管中加溶媒或藥液30μL，37℃恒溫溫育5 min。測(cè)定時(shí)用PPP管調(diào)幅至100%，再用PRP管調(diào)零；如此反復(fù)數(shù)次至穩(wěn)定。然后在磁棒攪拌下在PRP中加入誘導(dǎo)劑，凝血酶 （10 U/mL），并記錄血小板聚集率。

2.2 榅桲總黃酮對(duì)膠原蛋白-腎上腺素誘導(dǎo)小鼠肺血栓形成的影響 小鼠128只，體質(zhì)量18～23 g，雌雄各半，隨機(jī)分8組，分為生理鹽水對(duì)照組，榅桲葉總黃酮小、中、高劑量組 （60、120、240 mg/kg）組，榅桲果實(shí)總黃酮小、中、高劑量組 （60、120、240 mg/kg）組，阿司匹林組（15 mg/kg），連續(xù)灌胃給藥14 d，參照文獻(xiàn)［7］的試驗(yàn)方法，稱取膠原蛋白30 mg，用生理鹽水浸泡2 h以上，另取濃度為1 mg/2 mL的鹽酸腎上腺素2 mL加入上述溶液中，混勻，加生理鹽水至25 mL即可。于末次給藥后30 min尾靜脈注射膠原蛋白-腎上腺素混合誘導(dǎo)劑0.1 mL/10 g，造成小鼠體內(nèi)肺血栓模型。觀察注射誘導(dǎo)劑后15 m in內(nèi)死亡數(shù)和存活數(shù)。計(jì)算藥物對(duì)小鼠存活率。

2.3 榅桲提取物對(duì)大鼠動(dòng)-靜脈旁路血栓形成的影響 取SD大鼠64只，雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，隨機(jī)分為8個(gè)組：生理鹽水對(duì)照組，榅桲葉總黃酮小、中、大劑量（40、80、160mg/kg）組，榅桲果實(shí)總黃酮小、中、大劑量 （40、80、160 mg/kg）組，陽(yáng)性對(duì)照組阿司匹林 （10 mg/kg）連續(xù)給藥14 d。末次給藥1 h后腹腔注射20﹪烏拉坦0.5 mL/100 g，將麻醉大鼠，參考文獻(xiàn)［8-10］方法，在無(wú)菌條件下，將大鼠仰臥位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，頸部剪毛，常規(guī)消毒，鋪巾后沿頸前正中線做長(zhǎng)約3 cm切口，分離左總頸動(dòng)脈和右頸總靜脈。以聚乙烯管作動(dòng)-靜脈搭橋（動(dòng)-靜脈搭橋由4部分組成：動(dòng)脈端8cm，內(nèi)徑0.9mm，靜脈端8cm內(nèi)徑0.9 mm中間接頭段6 cm，內(nèi)徑1.5 mm，中段放入一根長(zhǎng)5cm精密稱質(zhì)量的棉線）。以肝素生理鹽水溶液 （50 U/m l）濕潤(rùn)聚乙烯管的動(dòng)脈端。聚乙烯管的靜脈端充滿生理鹽水，用動(dòng)脈夾夾住動(dòng)靜脈遠(yuǎn)心端，將聚乙烯管插入已分離出的右頸外靜脈，然后再將聚乙烯管的另一端插入左頸總動(dòng)脈，結(jié)扎固定后打開(kāi)動(dòng)脈夾，血液從左頸動(dòng)脈經(jīng)聚乙烯管流入右頸外靜脈。開(kāi)放血流15 min后迅速取出絲線稱質(zhì)量，總質(zhì)量減去絲線質(zhì)量即得血栓濕質(zhì)量，將榅桲總黃酮小、中、大劑量組與對(duì)照組進(jìn)行比較，求p值和血栓抑制率。

血栓抑制率=（生理鹽水組血栓質(zhì)量-給藥組血栓質(zhì)量）/生理鹽水組血栓質(zhì)量×100%

2.4 榅桲總黃酮對(duì)大鼠血栓素TXB2和6-keto-PGF1a的影響

SD大鼠，雌雄各半，64只，體質(zhì)量250～300 g，動(dòng)物分組，給藥，麻醉及手術(shù)方法同 “2.3”項(xiàng)在無(wú)菌條件下，造模15 m in后，快速分離腹主動(dòng)脈，采血EDTA抗凝管1管，顛倒混勻，離心3 500 r/min，15 min，分離血漿，采用放射免疫法檢測(cè)大鼠血漿中的6-酮前列腺素（6-keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）。具體操作步驟按照TXB2和6-keto-PGF1α放射免疫試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。用γ-放射免疫計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管數(shù)據(jù)求出直線回歸方程，計(jì)算出各樣本管TXB2和6-keto-PGF1α的量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s表示。采用Levene's test檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差齊性，方差齊則采用One-way ANOVA（單因素方差分析）法進(jìn)行多組間比較，若多組間比較有顯著性差異，則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；百分率的比較用χ2檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用spss 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。

3 結(jié)果

3.1 榅桲總黃酮對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的家兔血小板聚集的影響

結(jié)果顯示，榅桲 （葉和果實(shí)）總黃酮與血小板作用時(shí)間短的時(shí)候 （15 min），給藥劑量與聚集率成反比關(guān)系；作用時(shí)間延長(zhǎng)的時(shí)候 （30 min和45 min），量效關(guān)系不明顯。作用機(jī)制待進(jìn)一步深入研究。見(jiàn)表1。

表1 體外榅桲葉與果實(shí)黃酮對(duì)凝血酶 (1 U/m L)誘導(dǎo)血小板聚集的影響

3.2 榅桲黃總酮對(duì)膠原蛋白-腎上腺素誘導(dǎo)小鼠肺血栓形成的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與空白對(duì)照組比較，榅桲總黃酮各劑量組提高小鼠存活率，有顯著性差異 （P＜0.01）。榅桲高劑量組與阿司匹林組差異不顯著。可知榅桲總黃酮對(duì)膠原蛋白-腎上腺素混合誘導(dǎo)小鼠肺血栓有一定的保護(hù)作用。見(jiàn)表2。

表2 榅桲黃酮對(duì)膠原蛋白-腎上腺素混合誘導(dǎo)小鼠肺血栓形成的影響 (x±s,n=16)

3.3 榅桲提取物對(duì)大鼠動(dòng)靜脈旁路血栓質(zhì)量的影響 與空白組比較，阿司匹林組、榅桲葉總黃酮中、高劑量組和榅桲果實(shí)總黃酮各劑量組都能降低血栓濕質(zhì)量 （P＜0.01）。榅桲葉總黃酮高劑量組和榅桲果實(shí)總黃酮中、高劑量組降低血栓濕質(zhì)量的作用比阿司匹林組明顯。見(jiàn)表3。

3.4 榅桲黃酮對(duì)大鼠血栓素B2和6-keto-PGF1α的影響 與空白對(duì)照組比較，榅桲葉總黃酮各劑量和榅桲果實(shí)總黃酮中、高劑量可顯著降低TXB2水平 （P＜0.05或P＜0.01）。榅桲總黃酮 （果實(shí)和葉）中、高劑量組可顯著升高6-keto-PGF1α水平。榅桲葉總黃酮中、高劑量組和榅桲果實(shí)總黃酮高劑量組TXB2/6-keto-PGF1α比值也明顯降低（P＜0.05）。與阿司匹林組比較，榅桲葉總黃酮中、高劑量組和果實(shí)高劑量組有顯著差異 （P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表3 榅桲總黃酮對(duì)大鼠動(dòng)-靜脈旁路血栓形成的抑制作用(x±s,n=8)

表4 榅桲總黃酮對(duì)大鼠血漿中TXB2和6-keto-PGF1α的影響(x±s)

4 討論

由血栓引起的心血管疾病是影響人類健康的主要原因之一，血栓形成的發(fā)病機(jī)理中血小板發(fā)揮重要作用。血小板和血管壁之間的相互作用是血栓形成和心血管疾病如心肌梗死、中風(fēng)和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展的重要因素。一旦血管受損，血小板聚集迅速發(fā)生。這些血栓是動(dòng)脈硬化，心臟發(fā)作，中風(fēng)和周圍血管疾病的血栓栓塞并發(fā)癥的來(lái)源［11］。

體外血小板聚集功能的測(cè)定是反映血小板在誘導(dǎo)劑作用下發(fā)生聚集變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，是一種定量檢測(cè)。榅桲（葉和果實(shí)）總黃酮與血小板作用時(shí)間短的時(shí)候 （15 min），給藥濃度與聚集率成反比關(guān)系，葉子抑制聚集率作用明顯；作用時(shí)間延長(zhǎng)的時(shí)候 （30min和45min），量效關(guān)系不明顯，可能血小板功能降低有關(guān)。作用機(jī)制待進(jìn)一步深入研究。

本實(shí)驗(yàn)中，膠原蛋白與腎上腺素均是血小板聚集誘導(dǎo)劑，當(dāng)兩者合用時(shí)有顯著的協(xié)同作用，給小鼠尾部靜脈注射以后可誘發(fā)小鼠的血栓性偏癱和死亡。此模型引起的血栓與血小板的活化、黏附、釋放及再聚集有密切關(guān)系?？芍?，榅桲總黃酮對(duì)膠原蛋白和腎上腺素誘導(dǎo)的肺血栓有一定的保護(hù)作用，提高小鼠存活率，可能通過(guò)抑制血小板功能來(lái)達(dá)到抗血栓作用的。

動(dòng)-靜脈旁路血栓模型反映整體動(dòng)脈血流中血小板的黏附、聚集功能，形成的血栓結(jié)構(gòu)類似動(dòng)脈中的白色血栓，故與生理、病理情況比較接近［12］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，榅桲葉總黃酮中、高劑量組和榅桲果實(shí)總黃酮各劑量組都能降低血栓濕質(zhì)量 （P＜0.01）。榅桲葉高劑量組和果實(shí)中、高劑量組優(yōu)于阿司匹林組。表明榅桲總黃酮對(duì)血小板黏附、聚集所形成的血栓具有一定的抑制作用。

維持血漿TXA2和PGI2水平的相對(duì)平衡，對(duì)預(yù)防血栓及動(dòng)脈粥樣硬化具有重要意義。TXA2與PGI2在血漿中不穩(wěn)定，可自發(fā)水解為穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2及6-Keto-PGF1α測(cè)定血漿TXB2及6-Keto-PGF1α水平可反映TXA2及PGI2的合成量［13-14］。PGI2與TXA2的比值對(duì)于心血管系統(tǒng)生理功能的穩(wěn)定與調(diào)節(jié)至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，榅桲總黃酮可升高6-Keto-PGF1α水平及降低TXB2的水平，抗血栓作用可能與此有關(guān)。

通過(guò)不同的血栓模型考察榅桲不同部位總黃酮的抗血栓形成作用研究可知，榅桲葉總黃酮抗血栓形成作用比較明顯，可以考慮將榅桲葉作為今后重點(diǎn)研究藥用部位。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）07-1589-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.045

2014-04-15

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81260490）

輕曼古麗·阿吉（1984—），女，碩士，從事心血管藥理學(xué)研究。Tel：18609096153，E-mail：2461469160@qq.com

*通信作者：艾尼瓦爾·吾買爾（1962—），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事心血管藥理學(xué)研究。Tel：（0991）4365602，E-mail：anwar. umar@126.com