黃慶勇， 葉 淼， 李 煌， 張玉琴， 褚克丹， 徐 偉， 喬麗菲， 張國(guó)良

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

響應(yīng)面法優(yōu)選天花粉總皂苷的提取工藝

黃慶勇， 葉 淼， 李 煌， 張玉琴， 褚克丹， 徐 偉*， 喬麗菲， 張國(guó)良

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州350122）

目的利用響應(yīng)面法對(duì)天花粉總皂苷的回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度為自變量，以天花粉總皂苷提取率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法。結(jié)果天花粉總皂苷提取的最佳條件為料液比1∶15，提取時(shí)間120 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)48%，提取溫度88℃，提取2次，總皂苷提取率可達(dá)0.93%。結(jié)論該優(yōu)選工藝穩(wěn)定可行，實(shí)驗(yàn)真實(shí)值與建立的模型預(yù)測(cè)值基本一致。

天花粉；總皂苷；提取工藝；響應(yīng)面法

栝樓屬植物有80多種，其中我國(guó)有40多種，是栝樓屬植物的主要分布中心［1］，其中栝樓常用于臨床中藥。天花粉來源于葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.和雙邊栝樓Trichosanthes rosthornii Harms的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有清熱滌痰、寬胸散結(jié)等功效，代表方有：栝樓桂枝湯、栝樓牡蠣散和栝樓瞿麥丸［2］。天花粉的主要成分包括蛋白質(zhì)［3］、多糖、有機(jī)酸和三萜皂苷［4］等，具有抗病毒、抗炎和抗腫瘤等藥理作用［5］。研究表明天花粉總皂苷能夠清除DPPH自由基，具有體外抗氧化活性［6］，且對(duì)缺血性腦血管疾病具有較好的治療作用［7］。

與傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)相比［8］，響應(yīng)面法能夠在給出的整個(gè)區(qū)域找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式，從而找到整個(gè)區(qū)域中因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值［9］。該方法已廣泛運(yùn)用于食品［10］，化工［11］，機(jī)械［12］，藥學(xué)［13］等領(lǐng)域研究中。本實(shí)驗(yàn)通過單因素考察提取的時(shí)間、溫度、溶劑和物料比，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)選天花粉總皂苷的提取工藝，并驗(yàn)證該方法的可行性，旨在為天花粉總皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)及保健產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料 天花粉購(gòu)自河北省安國(guó)市天康藥材有限公司，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)楊成梓教授鑒定為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。齊墩果酸對(duì)照品（購(gòu)買自成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-11090502，HPLC級(jí)），無水乙醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器 CPA225D型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì) （島津）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋 （國(guó)華電器有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷測(cè)定方法［14］

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品1.90 mg，置于10mL量瓶中，加入無水乙醇超聲溶解，稀釋至刻度搖勻，即得0.19 mg/mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL的量瓶中，80℃恒溫水浴蒸干，加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 m L，60℃反應(yīng)10 min，冰浴冷卻后，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，在550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以加入齊墩果酸對(duì)照品溶液0 mL的溶液為空白對(duì)照。以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=4.471 0X-0.025 9（r=0.999 7），表明齊墩果酸質(zhì)量濃度在0.038～0.190 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 供試品溶液的制備 將天花粉粉碎，過80目篩，精確稱取天花粉粉末5.0 g，置于250 m L圓底燒瓶中，按單因素條件及Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行回流提取，提取2次，趁熱濾過，合并濾液，減壓濃縮至干，用適宜體積分?jǐn)?shù)乙醇超聲溶解，定容于10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 精密度考察 取同一供試品溶液，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)測(cè)定6次，得RSD為1.54%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性考察 精密稱取6份天花粉粉末，按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行提取，按 “2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，RSD為1.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，按 “2.1.2”項(xiàng)下步驟，分別在0、5、10、30、60、120 min測(cè)定，得出總皂苷吸光度的RSD為0.72%，表明樣品溶液在120 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量的天花粉粉末 （總皂苷為0.73%）6份，分別加入齊墩果酸對(duì)照品約0.02 mg，按上述方法進(jìn)行處理，測(cè)定各供試品溶液的吸光度值，按照公式 ［回收率 （%）=（加標(biāo)樣品實(shí)測(cè)值-樣品測(cè)定值）/加入對(duì)照品量 ×100%］計(jì)算平均回收率為98.8%，RSD為2.65% （n=6），結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度較高，符合測(cè)定要求。

2.1.8 樣品測(cè)定 精密量取0.2 mL供試品溶液，置10mL的試管中，80℃恒溫水浴蒸干，按 “2.1.2”項(xiàng)下步驟進(jìn)行測(cè)定。天花粉總皂苷提取率 （%）=天花粉總皂苷提取質(zhì)量/天花粉量×100%

2.2 單因素試驗(yàn) 以天花粉總皂苷提取率 （Y）為考察指標(biāo)，按 “2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，后按 “2.1.2”項(xiàng)下測(cè)定吸光度。分別考察料液比 （A）、提取時(shí)間 （B）、乙醇體積分?jǐn)?shù) （C）和提取溫度 （D）對(duì)總皂苷提取率的影響 （見圖1）。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：由圖1A可知，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)，提取率最高，故選擇1∶15為宜。由圖1B可知，當(dāng)提取時(shí)間為120 min時(shí)，提取率有最大值，隨提取時(shí)間的增加，提取率沒有明顯增加，從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，選擇120min較適合。由圖1C可知，提取率在用50%乙醇溶液提取時(shí)最高，之后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而減小，故選用50%乙醇進(jìn)行提取。由圖1D可知，提取率隨提取溫度的增加而增加，當(dāng)溫度為80℃時(shí)，提取率最高。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)考察

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［15］，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以料液比 （A）、提取時(shí)間 （B）、乙醇體積分?jǐn)?shù) （C）和提取溫度 （D）4個(gè)因素為自變量。每個(gè)自變量的低、中、高水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，以天花粉總皂苷提取率 （Y）為響應(yīng)值，因素水平見表1，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表1 天花粉總皂苷的提取工藝Box-Behnken中心組合試驗(yàn)因素水平

表2 天花粉總皂苷的提取工藝Box-Behnken中心組合試驗(yàn)安排

2.3.2 響應(yīng)面分析 利用ANOVA分析效應(yīng)面的回歸參數(shù)。采用DesignExpert8.0.6軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的二次多元回歸方程：Y=0.91+0.032A+0.033B-4.167×10-3C+0.048D+7.50×10-3AB+0.080AC-0.013AD-0.020BC-0.045BD-0.043CD-0.063A2-0.064B2-0.082C2-0.035D2。回歸方程中的各項(xiàng)系數(shù)見表3。

表3 回歸方程的顯著性檢驗(yàn)及方差分析

由表3可知：F回歸=22.63，P＜0.000 1，表明該模型極顯著，方程與實(shí)際情況擬合良好；失擬項(xiàng)P=0.053 6＞0.05，失擬檢測(cè)不顯著，表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾?。荒Ｐ拖嚓P(guān)系數(shù) R2=0.957 7，表明可信度良好；R2

Ad j= 0.915 4，說明91.54%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋。綜上，該模型可以對(duì)天花粉中總皂苷提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

回歸方程各項(xiàng)方差分析表明，因素A，B，D，AC，A2，B2，C2對(duì)提取率影響極顯著，因素BD，CD，D2具有一定的顯著性，其余均不顯著，表明各影響因素與總皂苷得率之間并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。從F值可以看出，單因素的影響順序?yàn)镈＞B＞A＞C。

響應(yīng)面分析立體圖見圖2，各圖為當(dāng)料液比 （A）、提取時(shí)間 （B）、乙醇體積分?jǐn)?shù) （C）和提取溫度 （D）中任意兩個(gè)變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對(duì)提取率的影響，可更加直觀體現(xiàn)兩個(gè)因素對(duì)提取率的影響。

圖2A顯示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、提取溫度為80℃時(shí)，料液比和提取時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的交互作用。根據(jù)等高線形狀以及響應(yīng)曲線陡峭程度，可判斷兩者的交互作用不顯著。提取率隨料液比或提取時(shí)間的增加或減少，變化不明顯。

圖2B顯示，在提取時(shí)間為120 min、提取溫度為80℃的條件下，料液比一定時(shí)，提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，提取率最小。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，提取率隨料液比的增長(zhǎng)，總體呈減小的趨勢(shì)。等高線呈橢圓形，響應(yīng)曲線坡度較陡，表示兩者交互作用極顯著。

圖2C顯示，料液比和提取溫度對(duì)總皂苷提取率的交互作用。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間一定時(shí)，提取率隨提取溫度的升高而顯著增加，隨料液比增大也有一定增加趨勢(shì)，當(dāng)料液比約為1∶16時(shí)，有極大值。

圖2 交互因素對(duì)總皂苷提取率影響的等高線及響應(yīng)曲面圖

圖2D顯示，當(dāng)料液比為1∶15、提取溫度為80℃時(shí)，提取率隨提取時(shí)間及乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，由低到高又降低，即提取率在適合的提取時(shí)間及乙醇體積分?jǐn)?shù)小具有極大值。

圖2E、2F顯示，提取時(shí)間和提取溫度，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度交互作用顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)曲線陡峭，等高線呈橢圓形且較密集，說明提取時(shí)間和提取溫度，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)總皂苷提取率有一定的影響。

綜上，料液比 （A）和乙醇體積分?jǐn)?shù) （C）對(duì)天花粉總皂苷得率的影響最顯著。在給定范圍內(nèi)，提取溫度越高（D），總皂苷的提取率越大；當(dāng)料液比 （A）為1∶16時(shí)，提取率可能有極大值。

2.3.3 最佳條件的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證試驗(yàn) 用DesignExpert軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)一步處理，可得出最優(yōu)條件為：料液比 （A）1∶15.15，提取時(shí)間 （B）120.16 m in，乙醇體積分?jǐn)?shù) （C）47.77%，提取溫度 （D）88.13℃，天花粉總皂苷提取率的預(yù)測(cè)值為0.928%?？紤]實(shí)際操作問題，以此條件的參數(shù)對(duì)工藝方法進(jìn)行修正：料液比 （A）1∶15，提取時(shí)間 （B）120 min，乙醇體積分?jǐn)?shù) （C）48%，提取溫度 （D）88℃。根據(jù)上述條件，平行測(cè)定3次，天花粉總皂苷提取率分別為0.937、0.931、0.928%，平均值為0.932%，RSD為0.49%，與預(yù)測(cè)值的偏差為0.43%。

3 討論

前期工作中，曾比較不同溶劑 （甲醇、乙醇）和不同提取次數(shù)對(duì)天花粉總皂苷提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取率差別不顯著，而隨提取次數(shù)的增大，提取率增加不明顯，從經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，最后確定利用乙醇對(duì)天花粉進(jìn)行提取，提取次數(shù)為2次。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn) （5個(gè)中心點(diǎn)）的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，相比目前國(guó)內(nèi)多采用的正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝方法，可以評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，結(jié)果更精準(zhǔn)，具有更強(qiáng)的指導(dǎo)性。實(shí)驗(yàn)比較了料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度四個(gè)因素對(duì)提取率的影響，考察較全面。建立了二次多項(xiàng)回歸模型，模型擬合良好，可用于天花粉總皂苷提取工藝的研究。最佳工藝條件確定為：料液比1∶15，提取時(shí)間120 m in，乙醇體積分?jǐn)?shù)48%，提取溫度88℃，天花粉總皂苷實(shí)測(cè)得率為0.932%。

天花粉能夠降血糖［16］，對(duì)缺血性腦卒中［17］有一定的保護(hù)作用，但具體的有效部位及有效成分尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)主要關(guān)注天花粉總皂苷的提取工藝，在今后工作中，將對(duì)其純化工藝及藥理活性進(jìn)行深入探討。

致謝:

本課題在康復(fù)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心和國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)康復(fù)研究中心資助下完成。

本實(shí)驗(yàn)在福建省科技廳福建省中藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中完成。

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R284.2

：B

：1001-1528（2015）07-1595-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.047

2014-03-12

福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目 （2012Y0041）；福建省教育廳項(xiàng)目 （JA12176）；福建中醫(yī)藥大學(xué)校管科研課題 （X2013016）

黃慶勇 （1989—），男，碩士生，從事中藥藥劑及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制研究。Tel：15806034728，E-mail：hqy8910@163.com

*通信作者：徐 偉（1975—），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物化學(xué)成分與活性研究。E-mail：xwfjtcm@sina.com

日期：2014-06-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20140630.1350.001.html