劉虎仙雷永紅綜述，韓巖審校

（1.北京解放軍總醫(yī)院整形修復科北京100853；2.北京解放軍第二炮兵總醫(yī)院整形外科北京100088；3.北京解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復重點實驗室北京100853）

·綜述·

Notch信號通路在組織血管化中的作用

劉虎仙1，2雷永紅3綜述，韓巖1審校

（1.北京解放軍總醫(yī)院整形修復科北京100853；2.北京解放軍第二炮兵總醫(yī)院整形外科北京100088；3.北京解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復重點實驗室北京100853）

組織移植中的血管新生是再生血管化基礎，國內(nèi)外在促進移植組織再生血管化這一臨床難題上已經(jīng)進行了大量的研究，有關(guān)基礎研究集中在外源因子促進ECs增殖［1-2］。但是，至今尚未闡明組織移植血管化過程中ECs的信號調(diào)控機制。當前，血管形成過程中的Notch信號通路在細胞分化、增殖、遷移等方面功能的研究已非常深入［3-4］。因此，本文對此進行綜述，希望透過信號網(wǎng)絡的視角能夠為移植組織再生血管化研究提供一些思路。

1　血管新生（neovasculorization）的基本過程

根據(jù)血管形成中內(nèi)皮細胞來源的不同，血管新生包含兩個基本過程和形式：即血管發(fā)生（vasculogenesis）和血管生成（angiogcnesis）。前者主要見于胚胎發(fā)育時，血管內(nèi)皮細胞來源于其前體即內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs），這種血管新生方式由中胚層的成血管細胞發(fā)育成血管系統(tǒng)。這種形式的血管發(fā)生可分為五個步驟［5·］：首先，內(nèi)皮祖細胞分化為內(nèi)皮細胞；之后，內(nèi)皮細胞形成原始聚合體建立細胞間連接；再次，新生內(nèi)皮管腔形成；進而，新生內(nèi)皮管腔形成原始血管網(wǎng)；最后，周細胞、血管平滑肌細胞形成。以往認為，血管發(fā)生不在胚胎時期的器官形成之外過程的發(fā)生。但亦有報道在成人中發(fā)現(xiàn)了來源于骨髓中的EPCs被動員到外周血中，隨后參與血管化過程［6-7］。在皮膚移植的血管化研究中也發(fā)現(xiàn)了上述類似的現(xiàn)象［8］。這些發(fā)現(xiàn)表明出生后的血管化不僅依靠血管生成（angiogcnesis），也可能依靠EPCs血管發(fā)生（vasculogenesis）。血管生成（angiogcnesis）是指已經(jīng)存在的微血管內(nèi)皮細胞通過出芽亦或非出芽或套疊等方式生長血管。出芽是常見的血管生成方式，即原始血管叢形成后，已形成的血管內(nèi)皮細胞外基質(zhì)降解，內(nèi)皮細胞趨化、遷移至外基質(zhì)降解處，并增殖形成有功能的管腔［4，9］。與血管發(fā)生不同，血管生成形態(tài)發(fā)生分為：①原代血管的擴張，減少內(nèi)皮細胞接觸；②原代血管基底膜被降解；③形成新生血管起始端；④毛細血管腔樣結(jié)構(gòu)形成；⑤基底膜合成；⑥周細胞和血管平滑肌細胞的形成。已生成的交換毛細血管柱或者細胞外基質(zhì)柱分裂形成腔隙的過程則認為是非出芽或套疊方式的血管生成。

盡管血管形成調(diào)控機制龐雜，但業(yè)已明確血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體（VEGF receptors，VEGFR）在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，控制著血管內(nèi)皮細胞的增殖、生存和遷移，并最終導致血管形成。在VEGF等多種信號通路的共同調(diào)控下，血管內(nèi)皮細胞發(fā)生分化產(chǎn)生極性改變［10］。根據(jù)其特性和位置，在血管形成中的部分呈絲狀偽足改變的內(nèi)皮細胞稱為尖端細胞（tip cell），另一類重要的血管內(nèi)皮細胞稱為柄細胞。血管形成中，尖端細胞對于血管芽生及促成分支起作用，柄細胞隨之跟進完成新生血管的增殖。不同部位的內(nèi)皮細胞存在不同濃度梯度的VEGF-A。尖端細胞感受到特定方向VEGF-A的刺激后，在特定方位通過絲狀偽足獲得延伸。緊隨細胞不斷增殖以滿足血管芽延伸和血管腔形成，最終形成成熟血管。最后，位置相鄰的尖端細胞之間相互融合，進一步形成血管網(wǎng)。這樣，從最初的EPCs分化為成熟的內(nèi)皮細胞，到新的毛細血管從原先存在的血管生出，這些細胞在無血管的區(qū)域增殖并且創(chuàng)造了第一個初始的血管網(wǎng)絡［11］。這個過程由多種元素共同參與和相互作用而產(chǎn)生，包括各種類型的細胞、黏附蛋白、生長因子、連接分子、內(nèi)源性抑制劑等［12-13］。此外，具有生理功能血管的形成，不僅需時間順序上的精確調(diào)節(jié)，也要在其成熟后抑制內(nèi)皮細胞的過度生長，從而抑制過多的營養(yǎng)和氧氣供應到組織［14］。越來越多的研究表明，Notch信號通路在整個血管新生的過程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用［15］。

2　Notch信號通路的基本組成

1914年，有研究者發(fā)現(xiàn)果蠅翅膀邊緣缺口（notch）是由其體內(nèi)某一基因的部分功能缺陷所導致，該基因即被命名為Notch基因［3］。后續(xù)的研究中人們把與這一現(xiàn)象相關(guān)的信號通路稱之為Notch信號通路。均為單次跨膜蛋白的Notch信號受體和配體直接介導了細胞間的相互作用。該通路主要由四部分組成：受體、配體、下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子以及靶基因［16］。哺乳動物存在四種Notch受體，即Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，均為多肽段構(gòu)成的異二聚體。四種受體均有胞內(nèi)區(qū)、胞外區(qū)及跨膜區(qū)。其中胞外區(qū)域包含有29～36個表皮生長因子EGFR樣的重復序列，而且第11～12個EGFR序列介導了受體與配體間的相互作用。Notch的胞外區(qū)域最主要的功能就是與配體結(jié)合并且負責將Notch信號向細胞內(nèi)傳遞而導致Notch信號通路激活，而Notch信號胞內(nèi)區(qū)域的主要作用就是將Notch信號傳送到細胞核內(nèi)［17］。哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)5個Notch配體［3］：即Dleta樣配體Dll4、Dll3、Dll1，Serrate樣配體Jagged-1、Jagged-2。Notch的配體同樣也具有EGFR樣的重復序列。Dll4是定位于人染色體15q14、基因編碼長度為685個氨基酸的單鏈跨膜蛋白。DLL4編碼蛋白在鼠和人中具有87%的同源序列［18］。提示DLL4在生物進化過程中保持了高度的保守性。在5個Notch配體中，有作者發(fā)現(xiàn)DLL4是唯一特異性表達于內(nèi)皮細胞，在病理性新生血管生長過程中及血管和淋巴管的新生、發(fā)育和成熟過程中起關(guān)鍵作用。

3　Notch信號通路血管生成中的作用機制

研究表明，相鄰細胞的Notch受體與其配體可相互結(jié)合從而激活Notch信號通路，擴大并造成細胞之間的分子水平差異，并最終導致細胞命運、器官形成和形態(tài)發(fā)生關(guān)鍵變化。

3.1 Notch信號通路作用的基本模式

Notch信號通路參與誘導和挑選尖端細胞，是血管密度的一個關(guān)鍵調(diào)控因子，在血管發(fā)生中扮演著重要作用，并與VEGF信號通路存在正負反饋調(diào)節(jié)，使血管協(xié)調(diào)高效的形成［19］。Dll4與Notch受體結(jié)合后，下調(diào)VEGFR的表達，抑制VEGF-A的效應，顯示出抑制血管分支效應［20］。阻斷DLL4/Notch信號通路后，表現(xiàn)為尖端細胞形態(tài)特征突出，血管分支增加，血管密度大幅增高。從而表明DLL4/Notch信號通路對VEGF誘導激活尖端細胞的作用形成重要的負反饋調(diào)節(jié)，即Notch信號的異位激活或缺失分別導致血管密度的減少或增加。柄細胞中的Notch信號負反饋抑制細胞核內(nèi)VEGF受體的表達，通過降低柄細胞與VEGF-A之間的響應來抑制其向尖端細胞表型分化趨勢，從而維持自身表型［21］。同時，降低柄細胞中Dll4的表達水平，導致尖端細胞只能接受較低活性的Notch信號，自身表型也得以維持。在柄細胞中高表達的Notch配體Jagged-1能拮抗其的Dll4，阻礙尖端細胞接受Notch信號，參與調(diào)控尖端細胞的挑選過程［22］。上述說明，內(nèi)皮細胞中的Notch信號活性和VEGF-VEGFR/Dll4-Notch這一信號回路處于動態(tài)平衡，從而保證了正常的血管萌芽和血管網(wǎng)絡構(gòu)建。

3.2 Notch信號通路的細胞組織特異性

需要指出的是，Notch信號通路在血管生成及組織再生血管化過程是否具有細胞特異性？原位雜交表明，Dl14集中表達在胚胎和成年組織的血管內(nèi)皮細胞，具有非常嚴格的組織特異性［23］。業(yè)已明確，Dl14很少在其他類型細胞表達，而主要表達在新生血管末端尖端細胞中［17］。在血管形成的數(shù)個階段，Dll4-Notch信號傳導通路均參與其中Dll4的組織定位或許間接提示它在新生血管的生長、發(fā)育、成熟過程中具有關(guān)鍵的作用。并與其他細胞因子或信號通路相互交織，共同完成血管形成中的復雜調(diào)控。

3.3 Notch/Dll4信號通路的作用環(huán)節(jié)

Notch/Dll4信號通路在血管內(nèi)皮細胞激活啟動血管形成方面提供了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)信息，且Dll4組織定位于新生血管末端尖端細胞中。則進一步需要證實的是，Notch/Dll4信號通路在血管生成的信號網(wǎng)絡中在哪個關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)揮作用？有文獻報道，減少VEGF的表達，Dll4的表達同時下降［24］。VEGF能同時誘導尖端細胞顯型和Dll4的表達，當抑制VEGF信號通路時，Dll4配體的表達量減少，因此，Notch1/Dll4信號通路可能是VEGF信號通路的下游細胞信號流，與VEGF共同調(diào)控血管萌發(fā)和分支的形態(tài)［25］。新生血管生成模型中，Dll4表達陽性的尖端細胞激活了相鄰柄細胞的Notch信號通路以阻止血管進一步芽生［26］。即Notch1/Dll4信號通路激活相對于VEGF信號通路而言限制了尖端細胞的數(shù)量；反之，Notch1/Dll4信號通路抑制將導致尖端細胞的上升和柄細胞數(shù)量的下降［27］。隨之引起的結(jié)果是血管密度的增加和新生血管的無節(jié)制芽生［28］。

3.4 Notch/Dll4信號通路與細胞外基質(zhì)

Notch信號除調(diào)控血管生成而外，還參與調(diào)控細胞外基質(zhì)分子的表達。小鼠胚胎在Dll4過度表達后，細胞外基質(zhì)成分：纖維連接蛋白，層黏連蛋白和膠原蛋白等，在小鼠胚胎的背側(cè)大動脈周圍高度表達和聚集［29］。最近的研究揭示Notch通路還可以通過基底膜蛋白和整合素信號等細胞外基質(zhì)上主動控制血管形態(tài)的發(fā)生［30］。這也從另一方面說明，Notch信號影響細胞外基質(zhì)成分的生成和分布，具有穩(wěn)定血管壁的作用，進而調(diào)控動靜脈分化。

3.5 Notch通路與動靜脈決定

以往認為，血液流動力學的調(diào)節(jié)是動靜脈分化的決定因素，原因是只有分化成熟后的動靜脈才能適應定向血流的壓力［31］。但目前研究表明［32］，胚胎干細胞分化成內(nèi)皮祖細胞后，決定其進一步分化為動脈或靜脈內(nèi)皮細胞的命運隨即就由Notch信號參與。并且在動脈發(fā)育過程中，Notch信號抑制動脈向靜脈表型的逆轉(zhuǎn)分化。動脈的特異性標志EphrinB2是一種小分子跨膜蛋白，其受體EphB4為酪氨酸激酶受體僅表達于靜脈系統(tǒng)，故通常作為靜脈標記物。Notch信號通路大多成員的表達局限于動脈內(nèi)皮部位［33］，當激活Notch信號后，EphrinB2基因被發(fā)現(xiàn)在靜脈內(nèi)皮細胞中異位表達。在斑馬魚中動脈內(nèi)皮細胞分化以及形成適當大小和數(shù)目的動脈血管，Notch信號起至關(guān)重要的作用，阻斷Notch3的結(jié)果是血管向動脈和靜脈表型分化行為紊亂以及動脈和靜脈血管畸形［34］。這些現(xiàn)象表明，動靜脈表型的分化和維持均需要較高活性的Notch信號［35］。

3.6 Notch信號對血管生成后修飾

Notch信號通路不但調(diào)控哺乳動物的胚胎發(fā)育，而且也在維持成年個體組織器官的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［36］。在人體急性創(chuàng)傷或急性缺血再灌注損傷時，阻斷Notch信號可以促進血管生成［37］。在血管形成后期，隨著血管重塑及進一步穩(wěn)定，Notch信號漸次失活，部分血管分支出現(xiàn)選擇性退化，初級血管叢發(fā)育為具備層級關(guān)系的成熟血管網(wǎng)絡，具備了正常功能。具體表現(xiàn)為斷開血管分支連接，多余血管分支被剪除，結(jié)果是血管密度持續(xù)降低，內(nèi)皮細胞重新恢復靜止休眠狀態(tài)等［38］。

4　問題與展望

近年來，國內(nèi)外學者對Notch信號系統(tǒng)進行了多方面研究，尤其是Dll4/Notch信號與VEGF在血管生成過程中的作用進行了深入的闡述，但研究主要集中于對腫瘤的血管形成方面。而在組織移植再生血管化方面，研究的相對較少。盡管腫瘤在演進過程中血管的生成和移植組織再生血管化有相似的過程，但其根本區(qū)別在于腫瘤的血管生成是血管異?；е履[瘤局部環(huán)境的惡性變化［39］，而組織移植再生血管化則要求生成有功能的血管且有利于改善局部血供的主動行為。相信通過進一步的深入研究，借鑒腫瘤組織血管生成機制，有望在移植組織再生血管化方面取得顛覆性的進展。

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編輯/李陽利

The role of Notch signaling pathway in tissue vascularization

注：劉虎仙，北京解放軍總醫(yī)院在讀博士

國家自然科學基金資助項目（81272123）

韓巖，主任、教授、主任醫(yī)師；研究方向：組織移植、創(chuàng)傷修復及異體復合組織移植；E-mail:13720086335@163.com

2015-3-10

2015-4-13