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(1.南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)礦業(yè)工程博士后科研流動(dòng)站；3.南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室)

·文獻(xiàn)綜述·

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在篩選生物標(biāo)志物方面的應(yīng)用研究進(jìn)展

李林蔚1，丁德馨2，李廣悅2，胡南2，易嵐1,2,3*

(1.南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)礦業(yè)工程博士后科研流動(dòng)站；3.南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物在腫瘤的早期診斷以及治療效果評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用日益廣泛。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在環(huán)境污染預(yù)警方面的作用也日益受到關(guān)注。本文就幾種常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分離分析技術(shù)及其在腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物、環(huán)境污染預(yù)警生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用做一綜述。

蛋白質(zhì)組學(xué)； 生物標(biāo)志物； 腫瘤； 環(huán)境污染

生物標(biāo)志物(biomarker)是指可以標(biāo)記系統(tǒng)、器官、組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能的改變或可能發(fā)生的改變的生化指標(biāo),如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、酶、脂類(lèi)、糖類(lèi)、代謝物等都可以作為生物標(biāo)志物用于研究。生物標(biāo)志物可應(yīng)用于疾病的早期診斷和監(jiān)測(cè)治療效果，發(fā)現(xiàn)治療藥物靶位[1-2]；可以闡明各種污染物的作用機(jī)理，確定各種污染物與生物體之間已發(fā)生的相互作用；此外，標(biāo)志物還可以用于流行病學(xué)或毒理學(xué)研究，以判斷生物是否暴露于某些環(huán)境因素中。篩選出有用的生物標(biāo)志物不但對(duì)疾病的診斷和治療有著重大的意義，并可以與生態(tài)學(xué)效應(yīng)相聯(lián)系，從而制定研究解決環(huán)境問(wèn)題的方案。以前常用于篩選生物標(biāo)志物的方法是基因組學(xué)，隨著人類(lèi)基因組測(cè)序的完成，人們發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)方式錯(cuò)綜復(fù)雜，基因組學(xué)不能回答人類(lèi)關(guān)于生命活動(dòng)的許多問(wèn)題，而蛋白質(zhì)才是基因功能的實(shí)施者，了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、定位和蛋白質(zhì)間相互作用和蛋白質(zhì)的功能則明顯更有利于了解生命現(xiàn)象的本質(zhì)，這便是蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)[3]。本文就蛋白質(zhì)組學(xué)在篩選生物標(biāo)志物中的研究進(jìn)展綜述如下。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

1.1蛋白質(zhì)組學(xué)分離標(biāo)記技術(shù)基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析的非標(biāo)記分離方法利用蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)不同來(lái)分離蛋白質(zhì)的雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)和雙向熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE)。基于和液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用的同位素標(biāo)記技術(shù)利用同位素編碼親和標(biāo)簽(ICAT)、細(xì)胞培養(yǎng)氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)或同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量標(biāo)記(iTRAQ)[4]等。

1.2蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)

1.2.1 質(zhì)譜技術(shù)(MS) 質(zhì)譜分析是一種測(cè)量離子荷質(zhì)比(電荷—質(zhì)量比)的分析方法，其基本原理是使試樣中各組分在離子源中發(fā)生電離，生成不同荷質(zhì)比的帶正電荷的離子，經(jīng)加速電場(chǎng)的作用形成離子束進(jìn)入質(zhì)量分析器,在質(zhì)量分析器中，再利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)使發(fā)生相反的速度色散，將它們分別聚焦而得到質(zhì)譜圖，從而確定其質(zhì)量。MS是不可或缺的核心蛋白質(zhì)組技術(shù),可以高度敏感和高通量鑒定蛋白質(zhì)或多肽以及轉(zhuǎn)錄后修飾。最常用的MS技術(shù)包括：基體輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI-TOF-MS、表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜SELDI-TOF-MS、MS/MS(串聯(lián)MS)等。近幾年MS技術(shù)發(fā)生了巨大的變化,出現(xiàn)新一代的質(zhì)量分析器和復(fù)雜的多級(jí)儀器如四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(Q-Q-TOF)和飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(TOF-TOF)等[5]。

1.2.2 定向蛋白質(zhì)組學(xué) 定向蛋白質(zhì)組學(xué)(targeted proteomics)技術(shù)是利用質(zhì)譜儀對(duì)一組經(jīng)過(guò)預(yù)篩選的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分析。這種預(yù)篩選過(guò)程是通過(guò)選擇反應(yīng)監(jiān)控技術(shù)(selected reaction monitoring，SRM)實(shí)現(xiàn)的，SRM根據(jù)待分析的目標(biāo)蛋白氨基酸序列，選擇對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)特異性肽段(proteotypic peptide，PTP)及PTP對(duì)應(yīng)的高響應(yīng)子離子，最后用高響應(yīng)子離子的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)反映該蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度。這些信號(hào)強(qiáng)度大且能夠確定唯一目標(biāo)蛋白的肽段被稱(chēng)為PTP，并與對(duì)應(yīng)的高響應(yīng)子離子組成一個(gè)母離子—子離子對(duì)。SRM實(shí)驗(yàn)通?；谌厮臉O桿(triple quadrupole，QQQ)串聯(lián)質(zhì)譜儀，也可以在線性離子阱(linear ion trap)質(zhì)譜儀或者四極桿—飛行時(shí)間(Q-TOF)質(zhì)譜儀上進(jìn)行[6]。與目前仍占主導(dǎo)地位的鳥(niǎo)槍法蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相比，使用了SRM的蛋白質(zhì)探測(cè)技術(shù)速度更快，更直接。因此，以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定向質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用在更廣泛的范圍內(nèi)迅速攀升，正在迅速成為一個(gè)可以替代或互補(bǔ)ELISA(目前蛋白質(zhì)定量的金標(biāo)準(zhǔn))的技術(shù)，并且能縮短實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物和臨床應(yīng)用之間差距[7-8]。

1.2.3 蛋白質(zhì)微陣列(蛋白質(zhì)芯片) 蛋白質(zhì)微陣列(protein microarrays)的基本原理是將抗原、抗體、小肽、受體和配體、蛋白質(zhì)-DNA和蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物等蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、載玻片等各種載體上制成芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用,洗去未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分,再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù),測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,通過(guò)熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系,由此達(dá)到測(cè)定各種蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)微陣列可分蛋白檢測(cè)芯片和蛋白功能芯片。蛋白檢測(cè)芯片將具有高度親和特異性的探針?lè)肿?如單克隆抗體)固定在基片上，用于識(shí)別復(fù)雜生物樣品中的目標(biāo)蛋白/多肽。蛋白質(zhì)功能微陣列是在陣列上包含完整的功能蛋白質(zhì)/域,可以研究蛋白質(zhì)的一個(gè)特殊亞型或整個(gè)蛋白質(zhì)組的生物化學(xué)活性[4,9]。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤相關(guān)生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

2.1蛋白質(zhì)組學(xué)在肺癌相關(guān)生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用肺癌是癌癥死亡的最常見(jiàn)原因之一，5年存活率在所有癌癥中是最低的，只有15%。肺癌的死亡率高，不僅是由于晚期診斷，而且即使被診斷為I期肺癌患者也缺乏有效的治療方法。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物用于肺癌的診斷、預(yù)后評(píng)估以及打開(kāi)新的治療途徑。

2.1.1 肺癌的診斷 Ding等[10]通過(guò)研究92例肺癌患者、38例細(xì)菌性肺炎患者和42例健康對(duì)照的血清和胸腔積液，發(fā)現(xiàn)肺癌患者中胸腔積液/血清的轉(zhuǎn)甲狀素蛋白TTR比值較細(xì)菌性肺炎患者的更高，應(yīng)用MALDITOFMS分析發(fā)現(xiàn)肺癌患者和細(xì)菌性肺炎患者的血清中有4個(gè)對(duì)應(yīng)TTR、Sul-TTR、Cys-TTR和Cysgly-TTR的主要峰，肺癌患者胸腔積液中的Cysgly-TTR比例增高，研究數(shù)據(jù)表明，結(jié)合胸腔積液/血清TTR比值和修飾后TTR能更有效的區(qū)別診斷肺癌患者與細(xì)菌性肺炎患者。

2.1.2 肺癌的預(yù)后評(píng)估 化療是大多數(shù)肺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，而只有少數(shù)晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者化療有效，所以通過(guò)生物標(biāo)志物評(píng)估肺癌患者化療治療的預(yù)后尤為重要，Voortman等[11]應(yīng)用MALDI-TOF-MS研究27例NSCLC患者用順鉑—吉西他濱和硼替佐米化學(xué)治療的血清肽質(zhì)譜，從血清肽豐度的動(dòng)態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，一種13肽標(biāo)志物在區(qū)別患者治療后是短的無(wú)惡化存活期(PFS)還是長(zhǎng)的無(wú)惡化存活期上具有86%準(zhǔn)確率、100%靈敏度和73%特異性，一種5肽標(biāo)志物在區(qū)分患者對(duì)治療是部分應(yīng)答還是不應(yīng)答具有89%準(zhǔn)確率、100%靈敏度和83%特異性。由于長(zhǎng)的PFS和較長(zhǎng)的總生存率相關(guān)，所以分析這些血清多肽組可能有助于預(yù)測(cè)晚期NSCLC患者的化療治療效果。

2.1.3 肺癌的新治療靶點(diǎn) 由于肺癌的80%以上都是NSCLC，所以找到治療NSCLC的靶點(diǎn)可以有效提高肺癌的5年存活率，Shaomin等[12]在三位手術(shù)NSCLC患者中取得約250 mg的腫瘤組織和非腫瘤鄰近組織，并用2D-DIGE技術(shù)從這兩種組織的組織間質(zhì)液(TIF)中得到24個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)分析這24個(gè)差異蛋白質(zhì)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的TIF過(guò)氧化物酶基因1(PRDX1)的表達(dá)上調(diào)，最后用ELISA驗(yàn)證了40例NSCLC患者平均為36 ng/mL的PRDX1明顯高于20例肺良性疾病患者平均6.26 ng/mL的PRDX1，研究表明，PRDX1可能與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度相關(guān)，PRDX1可以歸因于惡性轉(zhuǎn)化的NSCLC，并且可能成為NSCLC的治療靶點(diǎn)。

2.2蛋白質(zhì)組學(xué)在胰腺癌相關(guān)生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是一個(gè)治療方法有限的致命惡性腫瘤，具有非常高的死亡率，降低PC的死亡率不僅需要技術(shù)的進(jìn)步，而且需要檢測(cè)出對(duì)PC具有高特異性的新生物標(biāo)志物。由于晚期PC的5年存活率低，所以可以檢測(cè)出疾病蔓延前階段的早期診斷標(biāo)記就可以改變PC患者的命運(yùn)[13-14]。Pan等[15]應(yīng)用基于SRM技術(shù)的定向蛋白質(zhì)組學(xué)研究PC患者，慢性胰腺炎患者和正常人的血漿樣本中一組候選癌癥生物標(biāo)志物的含量，這5個(gè)候選癌癥生物標(biāo)志物包括人分層蛋白(14-3-3 protein sigma)、凝溶膠蛋白(gelsolin)、光蛋白聚糖(lumican)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶2(transglutaminase 2)和組織金屬蛋白酶抑制1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1)。研究發(fā)現(xiàn)，凝溶膠蛋白、光蛋白聚糖及組織抑制劑金屬蛋白酶1可能比CA19-9更能分辨PC患者和慢性胰腺炎患者或正常人。除此之外，結(jié)合相補(bǔ)充的個(gè)體生物標(biāo)記物可能在原有的特異性上提高生物標(biāo)志物的靈敏度，比如，雖然光蛋白聚糖可以很好的區(qū)分癌癥和健康對(duì)照者,但難區(qū)分癌癥和胰腺炎,凝溶膠蛋白能更好的區(qū)分癌癥和胰腺炎。比起光蛋白聚糖或凝溶膠蛋白各自單獨(dú)作為生物標(biāo)志物，兩者一起,作為一個(gè)聯(lián)合生物標(biāo)志物小組,可以表現(xiàn)出更高的靈敏度同時(shí)有95%特異性。所以，定向蛋白組學(xué)可以補(bǔ)充ELISA方法應(yīng)用于驗(yàn)證這些候選生物標(biāo)志物在臨床應(yīng)用中的潛在實(shí)用性[16]。

2.3蛋白質(zhì)組學(xué)在肝癌相關(guān)生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用肝細(xì)胞癌(HCC)是全球主要的致命癌癥，盡管有很多診斷方法，然而小肝結(jié)節(jié)等疾病與HCC的鑒別診斷仍然困難。先進(jìn)的成像技術(shù)，聯(lián)合輔助生物標(biāo)志物磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)、谷氨酰胺合成酶(GS)和熱休克蛋白70(HSP70)可以增強(qiáng)診斷的準(zhǔn)確性，但是，仍需準(zhǔn)確性靈敏性更高的生物標(biāo)志物來(lái)輔助鑒別診斷。Reis等[17]用非標(biāo)記技術(shù)和凝膠型蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出HCC(18例)和對(duì)應(yīng)的非腫瘤肝組織(NTLT)的一批差異候選蛋白質(zhì)，進(jìn)一步在HCC(78例)，肝細(xì)胞腺瘤(25例;HCA)，局灶性結(jié)節(jié)性增生(28例;FNH)，肝硬化(28例)中比較這些已知蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確率，發(fā)現(xiàn)14-3-3 Sigma(14-3-3S)顯示出最顯著上調(diào)(58.8倍)，并相對(duì)GPC3(64.7%)和GS(45.4%)有著更好的診斷準(zhǔn)確率(73.0%)，且具有高靈敏度(96.0%)。所以，14-3-3S是一個(gè)有潛力的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，可以進(jìn)一步改善肝細(xì)胞腫瘤鑒別診斷過(guò)程的準(zhǔn)確性。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在環(huán)境污染預(yù)警生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

3.1空氣污染預(yù)警生物標(biāo)志物篩選隨著生活質(zhì)量越來(lái)越好，人們的生存環(huán)境卻越來(lái)越差，各種工業(yè)過(guò)程、供熱、烹調(diào)過(guò)程中燃煤與燃?xì)饣蛉加团欧诺臒焿m、交通工具向大氣中排放的尾氣等污染造成城市空氣質(zhì)量下降，對(duì)人類(lèi)健康造成巨大的危害。顆粒物PM(particulate matter)可以通過(guò)呼吸進(jìn)入人體危害健康引發(fā)疾病，粗顆粒PM10(直徑2.5～10.0 μm)就可以吸入肺部，通常沉積在上呼吸道；細(xì)顆粒PM2.5(直徑<2.5 μm)可深入到細(xì)支氣管和肺泡；而超細(xì)顆粒(UFPs)和納米顆粒NP(直徑<0.1 μm)為人體的危害更大[18]。Kang等[19]用蛋白質(zhì)組學(xué)分析對(duì)比正常環(huán)境下小鼠哮喘模型和暴露在含有多環(huán)芳香烴(PAH)的UFP環(huán)境下小鼠哮喘模型的支氣管肺泡灌洗液蛋白組，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組支氣管肺泡灌洗液蛋白組有蛋白質(zhì)表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的上調(diào)，分別是多聚免疫球蛋白受體、補(bǔ)體C3、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)、幾丁質(zhì)酶3樣蛋白3、幾丁質(zhì)酶3樣蛋白4和酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶，研究中發(fā)現(xiàn)NGAL也許可以修復(fù)UFP引起的毒性，并可能是確定呼吸道氧化應(yīng)激狀態(tài)的有效生物標(biāo)志物。所以生物標(biāo)志物的研究將發(fā)現(xiàn)這些不利健康的顆粒對(duì)人體產(chǎn)生相關(guān)臨床表現(xiàn)前的早期生物事件提供有價(jià)值的預(yù)警信息[20]。

3.2核污染預(yù)警生物標(biāo)志物篩選隨著放射性物質(zhì)和電離輻射設(shè)備在國(guó)民經(jīng)濟(jì)各領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，這些放射性物質(zhì)本身或者其遺留物對(duì)生物環(huán)境和人類(lèi)造成的破壞也日益受到關(guān)注。這些核輻射物質(zhì)可以通過(guò)多種途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，成為“隱形殺手”，對(duì)生物物種造成各種損害[21]。因此，篩選出檢測(cè)速度快、對(duì)輻照敏感核污染預(yù)警生物標(biāo)志物，不僅為核污染的生物防護(hù)工作打下基礎(chǔ)，而且對(duì)生物物種甚至人類(lèi)起到保護(hù)作用。

近年，公眾越來(lái)越關(guān)注低劑量輻射對(duì)健康的影響。雖然高劑量率輻射暴露細(xì)胞反應(yīng)的分子事件已得到充分的研究，但是長(zhǎng)期暴露于極低劑量率輻射的影響目前尚不清楚。Nakajima等[22]通過(guò)二維電泳分析在低劑量率(0.032 μGy/min、0.65 μGy/min和13 μGy/min)照射485天的小鼠肝臟中蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中一種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化，被確定為硫氰酸酶(硫代硫酸硫轉(zhuǎn)移酶)，研究結(jié)果表明，硫氰酸酶是一種由低劑量率輻射引起的新蛋白質(zhì)，并進(jìn)一步分析能夠提供發(fā)現(xiàn)極低劑量率輻射暴露的影響。這種蛋白可能成為明確低劑量輻射效應(yīng)和新防御系統(tǒng)的關(guān)鍵[22]。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法的更新和研究數(shù)據(jù)的不斷積累，越來(lái)越多的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，但是，篩選出來(lái)的生物標(biāo)志物是否能達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的要求，還需要大量的研究和驗(yàn)證。

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2015-01-07；

2015-3-10

國(guó)家自然科學(xué)基金(81400117)，國(guó)防基礎(chǔ)科研重點(diǎn)項(xiàng)目(B3720132001)，中國(guó)博士后基金(2014M562115)，湖南省自然科學(xué)基金(2015JJ4042).

*通訊作者，E-mail:yilanoky@126.com.

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(此文編輯：朱雯霞)