龔梁，陳建強，魯杰，熊華，鄒堅定，陳亮宇

（溫州醫(yī)科大學附屬慈溪醫(yī)院，浙江慈溪315300）

EB病毒潛伏膜蛋白1在鼻咽癌組織中的表達及診斷意義

龔梁，陳建強，魯杰，熊華，鄒堅定*，陳亮宇

（溫州醫(yī)科大學附屬慈溪醫(yī)院，浙江慈溪315300）

目的探討EB病毒潛伏膜蛋白1（LMP-1）在鼻咽癌（NPC）組織中的表達，為早期篩查診斷NPC提供依據(jù)。方法采用MaxVision免疫組化的方法檢測60例NPC組織和60例鼻咽炎組織中的LMP-1表達，分析LMP-1陽性表達與NPC臨床病理特征的關系。結果LMP-1在NPC組織中的陽性表達率為63.3%（38/60），LMP-1在鼻咽炎組織中的陽性表達率為6.7%（4/60），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；LMP-1的表達與TNM分期、淋巴結轉移和臨床分期有關（P<0.05）；LMP-1篩查鼻咽癌的靈敏度為63.3%，特異度為93.3%，陽性預測值為0.905，陰性預測值為0.718，ROC曲線下面積為0.811（95%CI：0.731~0.891）。結論NPC組織中LMP-1的表達與TNM分期、淋巴結轉移、臨床分期有關，鼻咽組織中的LMP-1表達篩查鼻咽癌具有較高的特異度，輔助診斷NPC具有可行性。

EB病毒；鼻咽癌；潛伏膜蛋白1；診斷試驗

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）在中國是常見的惡性腫瘤之一。鼻咽癌的診斷，目前主要依賴于鼻咽鏡檢查和對病變組織的病理學檢查[1]，但因上述檢查皆具侵襲性，有部分患者不能一次明確病理診斷，需要反復多次進行活檢取材，故非鼻咽癌普查和疾病監(jiān)測的理想手段。目前發(fā)現(xiàn)，EB病毒的潛伏膜蛋白 1（latent membrane protein-1，LMP-1）基因是重要的致癌基因[2]，LMP-1是由EB病毒編碼的膜蛋白之一，EB病毒使細胞產(chǎn)生惡性轉化可能是通過致癌基因LMP-1實現(xiàn)的。因此，本文通過檢測鼻咽部標本中的LMP-1表達來評估其診斷鼻咽癌的靈敏度和特異度，為早期篩查診斷鼻咽癌提供依據(jù)，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年1月～2014年12月本院診治的鼻咽癌患者60例作為觀察對象，所有患者均經(jīng)過活檢組織病理確診，實驗室保存NPC患者的鼻咽組織標本。60例NPC患者中，男47例，女13例；年齡25~76歲，平均（57.6±9.4）歲；高分化鱗癌8例、低分化鱗癌32例、未分化癌20例；有淋巴結轉移37例、無淋巴結轉移23例；所有患者均未接受放療、化療等治療。收集同期住院的鼻咽炎患者60例作為對照組，排除鼻咽癌、鼻息肉、鼻竇炎，收集鼻咽組織標本。60例對照組中，男35例，女25例；年齡33~70歲，平均（54.8±8.1）歲。

1.2方法 經(jīng)病理活檢采集NPC組和對照組患者的鼻咽組織標本。LMP-1試劑盒采購于武漢中美科技有限公司，MaxVision免疫組化和DBA顯色試劑盒由福州邁新公司提供。具體步驟：組織石蠟切片，厚4μm，60℃恒溫箱內烤片1小時。二甲苯脫蠟和水化，酒精梯度脫二甲苯，蒸餾水清洗。微波法修

復抗原，置于3%H2O2溶液中室溫下孵育30分鐘，以去除內源性過氧化物酶活性。PBS液洗，滴加正常血清封閉液，37℃孵育10分鐘。滴加一抗，4℃過夜，PBS清洗。滴加二抗，37℃孵育20分鐘，PBS清洗。加鏈霉菌生物素—過氧化物酶溶液，37℃孵育20分鐘，PBS清洗。DAB顯色劑顯色，蘇木素復染，片烤干，封片，光鏡下觀察。免疫組化檢測結果的觀察及判斷細胞計數(shù)：以細胞質呈彌漫棕黃色細小顆粒為陽性細胞，每張切片上皮層隨機取8幅視野，采用全自動圖像分析儀對陽性細胞進行計數(shù)，在100倍顯微鏡下記錄視野中的陽性細胞數(shù)。光鏡下觀察陽性細胞百分比：無陽性細胞為0分，≤10%為1分，＞10%~50%為2分，＞50%~75%為3分，＞75%~100%為4分。染色強度：細胞質無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞百分比與染色強度的乘積≥3判定為LMP-1表達陽性[3]。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，檢驗水準α=0.05；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；診斷試驗采用受試者工作曲線（ROC曲線）分析法。

2 結果

2.1LMP-1的表達 LMP-1在NPC組織中的陽性表達率為63.3%（38/60），LMP-1在鼻咽炎組織中的陽性表達率為6.7%（4/60），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2LMP-1表達與臨床及病理的關系 通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，LMP-1的表達與TNM分期、淋巴結轉移和臨床分期有關（P<0.05），見表1。

2.3LMP-1免疫組化篩查鼻咽癌 由表2可知，LMP-1篩查鼻咽癌的靈敏度為63.3%，特異度為93.3%，陽性預測值為0.905，陰性預測值為0.718，ROC曲線下面積為0.811（95%CI：0.731~0.891），說明LMP-1免疫組化試驗篩查鼻咽癌的特異度較高，而靈敏度較差，見圖2。

3 討論

鼻咽癌與EB病毒有密切關系，主要原因有[4-5]：（1）從鼻咽癌組織中分離出帶EB病毒的類淋巴母細胞株的陽性率為68.7%，在電鏡下少數(shù)帶有EB病毒抗原的細胞中可找到EB病毒顆粒；（2）鼻咽癌患者體內的EB病毒抗體水平隨病情的發(fā)展而變化；（3）EB病毒在人以外靈長類或其他動物體內引起鼻咽癌；（4）幾乎所有的鼻咽癌組織中均可檢測到EB病毒基因組的存在。雖然EB病毒在成人中廣泛存在，但并非所有感染EB病毒的細胞都會表達致癌基因LMP-1，所以并非所有的EB病毒感染者都會發(fā)生鼻咽癌，絕大多數(shù)人群只是EB病毒的慢性攜帶者而不表達致癌基因LMP-1。通過檢測LMP-1的表達來診斷鼻咽癌，可能比檢測EB病毒基因組或EB病毒的血清VCA-IgA抗體具有更高的特異性。有研究表明，利用免疫組化技術可在50%～70%的鼻咽癌患者活檢組織中檢測到LMP-1的表達，本文的NPC患者鼻咽組織中LMP-1陽性表達率為63.3%，低于林錦等[6]報道PCR檢測LMP-1陽性表達率88.4%。

LMP-1表達與鼻咽癌其他臨床病理參數(shù)是否有關，目前研究報道未完全一致。本文結果顯示，TNM分期和臨床分期越高，LMP-1的陽性表達率越高，這說明晚期鼻咽癌（T3-T4期、III-IV期）組織中的LMP-1陽性表達率高于早期鼻咽癌（T1-T2期、I-II期）組織，提示LMP1表達可能與鼻咽癌的進展密切相關。LMP-1是目前被證實具有癌基因編碼蛋白的EB病毒基因產(chǎn)物。這與姜武忠等[7]報道的結果相似，而林錦等[6]報道的結果則無統(tǒng)計學意義，這可能與其樣本量較小有關。本文結果顯示發(fā)生淋巴結轉移組的 LMP-1陽性表達率為78.38%，明顯高于未發(fā)生淋巴結轉移組的39.13%，顯示LMP-1陽性表達與遠處淋巴結轉移有關，與李蓉等[8]報道結果相似。若能在NPC患者初診時就做LMP-1檢測可以預測NPC患者的轉移潛能，作為隨訪和評價預后的指標之一，可以指導臨床制定NPC的個性化治療方案，還可以為抗腫瘤轉移的靶向治療提供必要依據(jù)。本文嘗試采用免疫組化的方法來檢測鼻咽組織的LMP-1表達來診斷NPC，靈敏度為63.3%，特異度為90.3%，這說明LMP-1有助于輔助診斷NPC。但考慮到免疫組化法所檢測LMP-1表達篩查NPC的靈敏度較低，Hao等[9]報道，采用PCR法定量檢測EB病毒DNA可獲得更高的靈敏度和特異度，Raymond等[10]報道的靈敏度、特異度分別達到98.9%、99.3%。因此，本課題組下一步也將嘗試鼻咽拭子標本采用PCR法來檢測LMP-1基因，來確定其篩查NPC的診斷效果。

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浙江省自然基金（LY12H13002），浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃（2015RCB026），浙江省中醫(yī)藥重點研究計劃 （2012ZZ012），浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目 （2015ZB107、2013ZB115），寧波市自然科學基金（2012A610205、2012A610206），慈溪市科技計劃項目（CN2013013）

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