彭兆意，周喜洋

（天臺(tái)縣人民醫(yī)院，浙江 天臺(tái)317200）

·臨床研究·

HSPA2在人肝癌組織中的表達(dá)及臨床意義

彭兆意，周喜洋

（天臺(tái)縣人民醫(yī)院，浙江 天臺(tái)317200）

目的探討原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）組織中熱休克蛋白70-2（HSPA2）的表達(dá)及臨床意義。方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）和免疫組化法檢測(cè)120例HCC組織和癌旁組織中的HSPA2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，并分析HSPA2蛋白在HCC組織中的表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果RT-qPCR結(jié)果顯示，HSPA2 mRNA在50例HCC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常肝臟組織中（2.82±0.19與1.18±0.14，P<0.01）；免疫組化結(jié)果顯示，在120例HCC標(biāo)本中，HSPA2蛋白高表達(dá)有69例 （57.5%），低表達(dá)有51例（42.5%），HSPA2蛋白高表達(dá)與腫瘤長(zhǎng)徑、病理分化程度和腫瘤分期有關(guān)（P<0.05），而與年齡、性別、HBsAg狀態(tài)以及血清AFP水平無(wú)關(guān)（P> 0.05）。結(jié)論HSPA2在人HCC中高表達(dá)，其高表達(dá)可能與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能作為HCC早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的指標(biāo)。

肝癌；HSPA2；熱休克蛋白

熱休克相關(guān)蛋白70-2（heat shock-related 70-kDa protein 2，HSP70-2，HSPA2）是HSP70家族的一個(gè)成員，最初發(fā)現(xiàn)特異性地存在于精母細(xì)胞和精子中，與精子生成有關(guān)，被稱(chēng)為睪丸特異性蛋白，后來(lái)也被發(fā)現(xiàn)存在于其它腫瘤組織中，如乳腺癌、宮頸癌、膀胱癌、食管癌、肺癌、鼻咽癌等[1-2]。高表達(dá)HSPA2能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，提示其在腫瘤發(fā)生中起促進(jìn)作用[3]，但是HSPA2表達(dá)與原發(fā)性肝細(xì)胞癌（HCC）的臨床病理關(guān)系研究較少，本文通過(guò)RT-qPCR法和免疫組化法檢測(cè)HSPA2 mRNA和蛋白在肝癌組織以及癌旁組織中的表達(dá)，探討HSPA2

與HCC的臨床病理關(guān)系，以了解HSPA2在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1材料 收集2010~2013年間在本院手術(shù)切除的120例原發(fā)性肝癌組織及癌旁組織，其中男67例，女53例，年齡35~68歲，平均（54.1±6.3）歲，癌旁組織指距離腫塊>2cm的正常肝組織，所有病例術(shù)前均未行放化療以及介入治療，同時(shí)收集患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)徑、乙肝抗原是否陽(yáng)性、組織分化程度、術(shù)前血清甲胎蛋白（AFP）濃度和腫瘤分期等。120例原發(fā)性肝癌組織及其癌旁組織行免疫組化檢測(cè)，隨機(jī)選擇其中50例肝癌組織及癌旁組織，新鮮標(biāo)本取出后立即放入液氮中保存，用于行RT-qPCR檢測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)部分在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤外科實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)試劑 RNA提取試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （PrimeScript RTPCR Kit）和定量PCR試劑盒 （SYBR Premix Ex Taq）購(gòu)自于日本Takara公司；抗-HSPA2多克隆抗體和二抗均購(gòu)于美國(guó)cell signaling technology公司；二氨基聯(lián)苯胺底物試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；小牛凍干血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。人HSPA2基因引物序列和內(nèi)參基因β-actin的引物序列均由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1。

1.2.2RT-qPCR 采用RT-qPCR的方法來(lái)檢測(cè)標(biāo)本中HSPA2 mRNA的含量，組織標(biāo)本加入1mL Trizol后用勻漿器研磨，加入200μL氯仿，劇烈震蕩15秒，室溫靜置10分鐘后，12000rpm/min，4℃離心15分鐘，吸取上層水相加入等體積預(yù)冷的異丙醇置于-20℃30分鐘，再用12000rpm/min，4℃離心15分鐘后棄上清，用75%乙醇漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。Nanodrop 2000（美國(guó)）檢測(cè)總mRNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，制備cDNA產(chǎn)物，以β-Actin為內(nèi)參，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在實(shí)時(shí)定量PCR儀 （First7500美國(guó)）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10μL 2×SYBR Green Mix，正反鏈引物各1μL，4μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加滅菌雙蒸水至總反應(yīng)體積20μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2分鐘，94℃30秒，56℃ 30秒，72℃2分鐘，共40個(gè)循環(huán)，采用相對(duì)定量方法計(jì)算靶mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟標(biāo)本切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，3%H2O2清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高溫高壓修復(fù)。1%BSA封閉，滴加適當(dāng)稀釋一抗（1:100），室溫內(nèi)放置2~3小時(shí)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗。滴加二抗，室溫內(nèi)放置20分鐘，PBS清洗。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。以已知的陽(yáng)性表達(dá)的組織切片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS替代特異性一抗為陰性對(duì)照。

1.2.4結(jié)果判定 由2位病理學(xué)醫(yī)師對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。在高倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，觀察計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞。采用計(jì)分半定量法分析：（1）按陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞，0分；1%~10%陽(yáng)性細(xì)胞百分比，1分；11%～35%，2分；36%～70%，3分；>70%，4分；（2）按著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分和著色強(qiáng)度評(píng)分相乘，>6分為高表達(dá)，<4分為低表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用（）表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1RT-qPCR檢測(cè)HSPA2 mRNA在肝癌組織和癌旁組織的表達(dá) 50例HCC組織中的HSPA2 mRNA表達(dá)水平比50例癌旁組織的表達(dá)水平顯著升高（2.82±0.19與1.18±0.14，P<0.01），見(jiàn)圖1。

2.2免疫組化法檢測(cè)HSPA2蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，120例肝癌組織標(biāo)本中，HSPA2蛋白在69（57.5%）例中高表達(dá)，51（42.5%）例中低表達(dá)，在癌旁組織中，HSPA2蛋白有8（6.7%）例高表達(dá)，112（93.3%）例低表達(dá)，與肝癌組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖2~3、表2。

2.3HSPA2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 HSPA2蛋白高表達(dá)與腫瘤長(zhǎng)徑、病理分化程度和腫瘤分期有關(guān)均（P<0.05），而與年齡、性別、HBsAg狀態(tài)以及血清AFP水平無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，進(jìn)展快、死亡率高，由于肝癌早期癥狀不明顯，診斷的時(shí)候往往已是晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而且肝癌對(duì)放化療不敏感，因此，探索HCC的發(fā)病機(jī)制以及早發(fā)現(xiàn)和早診斷非常重要[4]。AFP是目前應(yīng)用最廣泛的肝癌腫瘤標(biāo)志物，但是特異性和敏感性不高，在活動(dòng)性肝病，妊娠、生殖腺胚胎源性腫瘤和少數(shù)消化道腫瘤中也可有AFP的增高，顯示AFP診斷肝癌的局限性[5]。因此尋找一種能早期診斷HCC的標(biāo)志物有著重要的臨床意義。

HSP是一組在進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核和真核生物中，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、蛋白合成、細(xì)胞骨架的功能等，與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和惡變過(guò)程密切相關(guān)[6]。HSP能與多種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)合體進(jìn)而調(diào)節(jié)靶蛋白的活性和功能，故也被稱(chēng)為 “分子伴侶”[7]。根據(jù)分子量以及等電點(diǎn)的不同，HSP可分為HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110等家族，其中，HSP70一族是在細(xì)胞內(nèi)含量最高和功能最重要的熱休克蛋白，它通過(guò)參與原癌基因c-myc、c-fos和抑癌其因p53及其蛋白產(chǎn)物的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖[8]。下調(diào)肺癌細(xì)胞株A549的HSP70表達(dá)，不僅可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖還可誘導(dǎo)凋亡，提示HSP70可能作為一種重要的基因控制著腫瘤細(xì)胞的增生及凋亡[9]。Yang等[10]通過(guò)微陣列檢測(cè)肝癌組織發(fā)現(xiàn)，HSP70在早期肝癌中過(guò)表達(dá)，可能是由于腫瘤形成后血液供應(yīng)不充分處于營(yíng)養(yǎng)缺乏和低氧應(yīng)激環(huán)境下刺激 HSP70合成，致HSP70表達(dá)增加，是區(qū)分早期肝癌與癌前病變?nèi)缇凭愿尾』蚍前└谓M織等的敏感標(biāo)志物。

HSPA2是HSP70家族成員，早期對(duì)HSPA2功能的研究局限在精子發(fā)育方面。近年研究表明，HSP70在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，可與凋亡信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白和激酶相互作用抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，沉默HSPA2后可通過(guò)影響細(xì)胞周期和線粒體凋亡通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖[11]。

本文結(jié)果顯示，HSPA2基因在HCC腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，免疫組化結(jié)果顯示，在癌旁正常肝組織中HSPA2不表達(dá)或低表達(dá)，而在HCC組織中，HSPA2呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，且與腫瘤長(zhǎng)徑、分化程度以及分期有關(guān)，表明HSPA2蛋白與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及遷移有關(guān)，早期患者HSPA2即表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)，提示可能作為早期診斷的標(biāo)志物，HSPA2的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后還需要進(jìn)一步地研究。

總之，研究HSPA2在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，有利于更加深入地了解肝癌的發(fā)病機(jī)制，既往研究顯示消除HSPA2能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，說(shuō)明HSPA2對(duì)肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有關(guān)鍵作用，因此，治療上利用HSPA2的抑制劑來(lái)抑制HSPA2的合成，將有可能控制腫瘤生長(zhǎng)，也許能為今后治療肝癌提供一種新的思路。

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