夏海娜，張淼，葉晶晶，陳沛，樂(lè)舟燕

（舟山市普陀區(qū)人民醫(yī)院，浙江 舟山316100）

miR-182在體內(nèi)外肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)肝癌的診斷價(jià)值

夏海娜，張淼，葉晶晶，陳沛，樂(lè)舟燕

（舟山市普陀區(qū)人民醫(yī)院，浙江 舟山316100）

目的探討miR-182在體內(nèi)和體外細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)肝癌的診斷價(jià)值。方法熒光定量PCR檢測(cè)正常肝細(xì)胞系L-O2與肝癌細(xì)胞系HepG2、HepG3B、Huh7的miR-182表達(dá)，以及肝癌組和對(duì)照組各40例miR-182的表達(dá)。并且用ROC曲線分析血漿miR-182對(duì)肝癌的診斷效能。結(jié)果（1）HepG2、HepG3B及Huh7三種肝癌細(xì)胞系的miR-182表達(dá)水平均顯著高于正常肝細(xì)胞系L-O2（均P<0.05）；（2）肝癌組血漿miR-182相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組（P<0.05）；（3）肝癌組miR-182的異常表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小無(wú)顯著相關(guān)性（均P>0.05），而與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P<0.05）；（4）ROC曲線分析提示miR-182診斷肝癌的曲線下面積（AUC）為0.852（95%CI: 0.762~0.942），敏感度為87.5%，特異度為80.0%，約登指數(shù)為0.675，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為△Ct1=5.25，當(dāng)?shù)陀谶@個(gè)值時(shí)，提示miR-182表達(dá)升高，罹患肝癌的可能性增大。結(jié)論血漿miR-182的高表達(dá)可能成為肝癌診斷的新方法。

miR-182；肝癌；體內(nèi)外；診斷

肝癌是世界上致死率第二的惡性腫瘤，患者在被確診為肝癌時(shí)往往已經(jīng)達(dá)到中晚期，使該病預(yù)后不良[1]。早期診斷和治療是提高肝癌治療效果的關(guān)鍵因素，因此發(fā)展更新更好的方法診斷肝癌意義重大。MicroRNA是近年來(lái)備受關(guān)注的一類細(xì)胞內(nèi)源性、非編碼的小分子RNA，通過(guò)與其靶mRNA分子的3′端非編碼區(qū)（3′-UTR）不完全互補(bǔ)配對(duì)，調(diào)節(jié)靶基因在轉(zhuǎn)錄后的蛋白表達(dá)水平[2]。研究發(fā)現(xiàn)血漿中一些特定的MicroRNA可指示腫瘤的發(fā)生[3]，本研究探討了血漿miR-182對(duì)肝癌的診斷價(jià)值，報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2012年5月~2014年9月在本院就診的肝癌患者40例作為肝癌組，均未行化療、放療或其他腫瘤相關(guān)治療，其中男29例，女11例，年齡33~68歲，平均（48.0±15.7）歲，均經(jīng)病理確診。按2010年AJCC TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期13例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例。另選擇同期40例健康人作為對(duì)照組，其中男27例，女13例，年齡31~70歲，平均（45±18.3）歲。兩組性別、年齡一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 人肝癌細(xì)胞株 HepG2、Hep3B、Huh7和人正常肝細(xì)胞系L-O2購(gòu)于上海生科院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)在RPIM-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37℃恒溫培養(yǎng)并通入5%二氧化碳。實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基，胎牛血漿購(gòu)于美國(guó)Gibco。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen。SYBR Green試劑購(gòu)于日本TaKaRa。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1miR-182的檢測(cè) 定量PCR檢測(cè)miR-182的表達(dá)：取培養(yǎng)的細(xì)胞或血漿，按試劑說(shuō)明書(shū)，用Trizol試劑提取總RNA。miR-182的逆轉(zhuǎn)錄采用特異性莖環(huán)引物法[4]，按試劑說(shuō)明進(jìn)行miR-182的逆轉(zhuǎn)錄。miR-182逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA TTCAGTTGAGAGUGUGAG-3′。將該逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用SYBR Green(TaKaRa，Japan)試劑盒進(jìn)行定量PCR，miR-182定 量 PCR 上 游 引 物 ：5′-ACACTCCAGCTGGGUUUGGCAAUGGUAGAACU-

3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。將U6作為內(nèi)參?！鰿t1=CT（患者血漿/正常人血漿miR-182表達(dá)）-Ct（患者血漿/正常人血漿U6表達(dá)），△Ct2=CT（正常人血漿miR182表達(dá)）-Ct（正常人血漿U6表達(dá)），△△Ct=△Ct1-平均△Ct2，miR-182的相對(duì)表達(dá)以2-△△CT表示[5]。

2.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 （）表示并用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，血漿中miR-182表達(dá)水平的差異通過(guò)Mann-Whitney U檢驗(yàn)。利用ROC曲線來(lái)確認(rèn)miR-182鑒別肝癌患者及健康者的診斷價(jià)值。

3 結(jié)果

3.1體外細(xì)胞試驗(yàn) HepG2、HepG3B及Huh7三種肝癌細(xì)胞系的miR-182表達(dá)水平均顯著高于正常肝細(xì)胞系L-O2（P<0.05），詳見(jiàn)表1。

表1 體外肝癌和正常肝細(xì)胞系miR-182相對(duì)表達(dá)水平（）

與L-O2細(xì)胞系比較*P<0.05

細(xì)胞系 n/孔 miR-182相對(duì)表達(dá)水平L-O2 3 1.00±0.07 HepG2 3 4.35±0.35*HepG3B 3 5.12±0.42*Huh7 3 3.95±0.31*

3.2miR-182與臨床病理特征的關(guān)系 肝癌組與對(duì)照組血漿miR-182相對(duì)表達(dá)水平分別為5.43±3.67和1.00±0.82，兩組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。肝癌組miR-182的異常表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小無(wú)顯著相關(guān)性（均P>0.05），而與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P<0.05）。詳見(jiàn)表2。

3.3ROC曲線分析 將患者/正常人血漿miR-182 Ct值與患者/正常人血漿U6 Ct值的差值（即△Ct1）作為檢測(cè)指標(biāo)，分別統(tǒng)計(jì)對(duì)照組的△Ct1和肝癌患者的△Ct1值，并用ROC曲線分析。結(jié)果提示miR-182對(duì)肝癌患者和健康對(duì)照者診斷肝癌的曲線下面積（AUC）為0.852（95%CI:0.762~0.942），敏感度為87.5%，特異度為80.0%，約登指數(shù)為0.675，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為△Ct1=5.25，當(dāng)?shù)陀谶@個(gè)值時(shí)，則提示miR-182表達(dá)升高，罹患肝癌的可能性增大。詳見(jiàn)圖1。

4 討論

近年來(lái)的研究表明MicroRNAs表達(dá)譜的改變和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，癌變細(xì)胞能通過(guò)改變細(xì)胞microRNA表達(dá)譜促進(jìn)致癌基因的表達(dá)和抑癌基因的沉默，可以作為一種新的腫瘤診斷標(biāo)志物，其在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，有效提高了惡性腫瘤的早期診斷率[6]。

MiR-182是一種致癌miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miR-182的高表達(dá)可促進(jìn)肝癌、卵巢癌和肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7-9]。本研究作者首先在體外檢測(cè)正常肝細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系miR-182的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)三種肝癌細(xì)胞系的miR-182表達(dá)水平均較正常肝細(xì)胞系顯著增加（P＜0.05），提示miR-182可能在肝癌患者腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)；同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)肝癌組血漿miR-182的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，并且miR-182的水平還和肝癌患者的臨床分期、分化程度和是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，分化程度越低、臨床分期越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者血漿miR-182水平越高，這些結(jié)果提示血漿中miR-182水平可能有助于肝癌的診斷。

為了研究血漿中miR-182對(duì)肝癌的診斷價(jià)值，作者用AUC-ROC曲線進(jìn)行分析，結(jié)果提示其曲線下面積為0.852，說(shuō)明血漿miR-182水平對(duì)于肝癌的診斷有較高的價(jià)值，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為△Ct1= 5.25，即當(dāng)患者血漿miRNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，若（miR-182 CT值-U6 CT值）小于5.25時(shí)，表示患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增加。

綜上所述，血漿miR-182的檢測(cè)可能為肝癌的早期診斷提供新的方法。

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