楊松濤，金宏麗，高玉偉，王化磊，夏咸柱

埃博拉病毒感染及免疫逃逸機(jī)制研究進(jìn)展

楊松濤，金宏麗，高玉偉，王化磊，夏咸柱

埃博拉病毒（EBOV）可引起嚴(yán)重的埃博拉出血熱，在靈長類中死亡率接近90%。EBOV感染機(jī)體后，可干擾宿主的免疫反應(yīng)，從而有利于病毒的復(fù)制和傳播。本文針對EBOV感染機(jī)體過程、EBOV免疫逃逸機(jī)制和治療策略等進(jìn)行綜述。

埃博拉病毒；病毒感染；免疫逃逸；治療策略；綜述

埃博拉出血熱是由埃博拉病毒（EBOV）感染引起的一種烈性的人獸共患傳染病，其致死率高、臨床治療能力薄弱。2014年爆發(fā)的埃博拉疫情引起全球關(guān)注，截止到2015年11月8日，共引起全球28 635例感染、11 314例死亡，成為人類最大的一次埃博拉暴發(fā)疫情。WHO已將西非埃博拉病毒病疫情列為“國際突發(fā)公共衛(wèi)生緊急事件”。

EBOV是對人類危害最嚴(yán)重的病毒之一，目前尚無有效的治療藥物和疫苗。由于EBOV存在生物安全隱患；疫區(qū)主要在缺少現(xiàn)代先進(jìn)設(shè)施的偏遠(yuǎn)地帶；疫情暴發(fā)具有散在、不可預(yù)知性和病毒監(jiān)視不足等原因[1]，以致許多關(guān)于病毒致病性的研究都是在動物模型和體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行的[2]，而關(guān)于人體的相關(guān)實(shí)驗(yàn)很少。病毒感染機(jī)體的每個階段，從病毒進(jìn)入細(xì)胞、局部復(fù)制、傳播（病毒血癥）、在靶器官內(nèi)繁殖、患者康復(fù)（但仍帶毒）或死亡，均存在兩種因素的相互制約：病毒感染和宿主免疫防御。EBOV可利用多種機(jī)制逃逸宿主的免疫應(yīng)答，從而有利于病毒的復(fù)制和快速傳播。研究EBOV對人類的致病機(jī)理和免疫逃逸機(jī)制，進(jìn)而根據(jù)這些關(guān)鍵步驟，確定新型靶標(biāo)位點(diǎn)，研發(fā)治療藥物，對于埃博拉出血熱的綜合防控具有重要意義。

1 病毒感染過程

EBOV感染性很強(qiáng)，可通過接觸感染者的分泌物、血液、排泄物、皮膚傷口和被污染的物品等多種途徑傳播。EBOV病毒基因組外側(cè)由脂質(zhì)膜包裹，有利于病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，并且EBOV可在多種人類細(xì)胞中復(fù)制，包括免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞和腎上腺細(xì)胞[3]。病毒外膜與宿主細(xì)胞膜的受體結(jié)合和融合過程中，病毒膜蛋白（GP）起重要作用[3]。此外，EBOV主要靶向巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，隨后通過GP的黏液素樣區(qū)域感染內(nèi)皮細(xì)胞[4-5]。因此，病毒首先廢除免疫系統(tǒng)，然后影響血管系統(tǒng)，導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血、出血、休克和死亡。病毒也會影響其他器官和組織，導(dǎo)致多器官的衰竭，包括肝（多病灶壞死、凝血因子產(chǎn)量減少）、腎上腺（甾類產(chǎn)生的停止、惡化血壓的調(diào)節(jié)）和胃腸（腹瀉）[6]。所有的臨床癥狀均與病毒不可控的傳播和復(fù)制有關(guān)，但具體的機(jī)制尚不完全明確。目前認(rèn)為的病毒感染機(jī)體有3個階段：（1）在感染早期，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞是EBOV最早的靶細(xì)胞。這些細(xì)胞被大量感染后，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)和炎癥趨化因子（如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1和嗜酸細(xì)胞活化趨化因子）的過表達(dá)。這種“細(xì)胞因子風(fēng)暴”可吸引炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞）至感染組織，導(dǎo)致凝血異常并增加內(nèi)皮通透性[7]。（2）病毒進(jìn)入二級淋巴器官和肝臟，進(jìn)行大量復(fù)制并感染其他細(xì)胞。此階段發(fā)生彌散性血管內(nèi)凝血，導(dǎo)致凝血因子的消耗、血纖蛋白沉積和血凝塊的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致全身出血[6]。（3）細(xì)胞病變和宿主反應(yīng)引起肝細(xì)胞多病灶壞死和其他組織損傷，最終導(dǎo)致多器官衰竭，患者休克并死亡。

2 病毒逃逸免疫反應(yīng)機(jī)制

EBOV感染的每個階段，均可激活機(jī)體產(chǎn)生先天性免疫反應(yīng)和特異的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，宿主的存亡與體內(nèi)特異性抗體的產(chǎn)生有直接聯(lián)系[8-9]。如果患者體內(nèi)較早產(chǎn)生高水平的體液免疫反應(yīng)，常會存活下來[6,10]。然而，大多數(shù)EBOV感染會導(dǎo)致宿主的死亡[7]，臨床上瀕死患者體內(nèi)無特異性IgG，也幾乎檢測不到IgM的產(chǎn)生。已有研究表明，EBOV可通過多種機(jī)制影響并逃逸宿主產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。

2.1 通過VP35和VP24蛋白阻斷干擾素反應(yīng) I型干擾素（IFN-α/β）的產(chǎn)生可阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞并抑制病毒在局部復(fù)制[11]。EBOV編碼的兩種核蛋白VP24、VP35，可阻斷干擾素的產(chǎn)生和信號通路的活化。VP35通過多種機(jī)制抑制IFN-α/β的產(chǎn)生[5,11]，包括抑制ERF-3的磷酸化作用、使IRF-7失活、抑制IFN可誘導(dǎo)的dsRNA和Dicer依賴蛋白激酶R的活化。另外，VP35還可與dsRNA結(jié)合，使其不被視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I（RIG-I）識別，抑制一系列協(xié)同刺激分子（包括CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ類分子）的上調(diào)和樹突狀細(xì)胞的成熟。VP24通過阻止兩面神激酶-1（JAK-1）的同源二聚化和酪氨酸激酶-2（TYK-2）的異源二聚化，阻止轉(zhuǎn)錄因子的核定位，減少或抑制干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞對IFN-α/β/γ的作用不敏感。這種通過VP35和VP24蛋白阻斷干擾素反應(yīng)的現(xiàn)象與絲狀病毒毒力增強(qiáng)有密切關(guān)系。

2.2 通過sGP調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng) EBOV的GP基因通過mRNA剪輯，可編碼一種跨膜蛋白GP1,2和兩種分泌的非結(jié)構(gòu)蛋白：可溶性的糖蛋白sGP和小可溶性糖蛋白ssGP。GP1,2是病毒表面唯一的蛋白，是抗體產(chǎn)生的靶標(biāo)[12-13]，但GP1,2產(chǎn)生比例不高，sGP與GP1,2在轉(zhuǎn)錄水平上的比例是2.8∶1，在蛋白質(zhì)水平比例是4.4∶1[14]。同GP1,2相比，sGP在血清中含量較多，且sGP與GP1,2有相同的N端，因此sGP既可作為誘餌抗原，與抗GP1,2抗體結(jié)合，控制宿主的體液免疫反應(yīng)[15]，也可抑制GP抗血清的中和活性[16]。因此，在被感染的患者和非人靈長類血液內(nèi)均可檢測到sGP的存在[17]，且幸存者血液中的抗體與sGP發(fā)生交叉反應(yīng)的程度大于同GP1,2反應(yīng)的程度[18]。

sGP還可轉(zhuǎn)移免疫反應(yīng)。研究者提出[19]，宿主感染EBOV后再次面對感染時，機(jī)體動員可識別GP1,2和sGP的記憶B細(xì)胞。但由于sGP含量多，B細(xì)胞識別sGP表位的幾率明顯提高。此外，如果對小鼠首免GP1,2，當(dāng)再使用sGP進(jìn)行加強(qiáng)免疫時，會發(fā)現(xiàn)抗GP1,2的反應(yīng)對sGP的存在很敏感。一種可能的解釋是：即使在這些動物體內(nèi)，活化的B細(xì)胞主要針對GP1,2獨(dú)有的表位（sGP沒有），但仍有少部分B細(xì)胞可針對sGP。當(dāng)使用sGP加強(qiáng)免疫時，這些少量的針對sGP的B細(xì)胞會大量增加，干擾針對GP1,2的B細(xì)胞發(fā)揮作用。在實(shí)際應(yīng)用中，大部分EBOV疫苗都以GP1,2為靶標(biāo)，然而當(dāng)機(jī)體免疫疫苗后再感染EBOV時，如果抗體水平不夠而不能快速清除病毒，病毒就會通過復(fù)制產(chǎn)生sGP，sGP將逐漸轉(zhuǎn)移抗體反應(yīng)使其針對自己，從而表現(xiàn)出免疫失敗。

sGP有長刺突，含有非常大的、高免疫原性的黏蛋白樣區(qū)域，此區(qū)域可導(dǎo)致受感染細(xì)胞的分離與死亡。sGP還可通過減少由腫瘤壞死因子-α（TNF-α）引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，阻止白細(xì)胞接近感染部位[20]，進(jìn)而有利于病毒的增殖。

2.3 GP1,2蛋白的作用 GP1,2蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生先天性免疫和早期的獲得性免疫反應(yīng)，快速清除受感染的細(xì)胞。病毒通過對GP1,2蛋白的嚴(yán)重糖基化，將表位隱藏，從而出現(xiàn)病毒屏蔽[21-22]。此外，EBOV還可能通過mRNA剪輯，減少GP1,2的產(chǎn)生，在保證病毒可進(jìn)行有效復(fù)制的同時，降低GP1,2對受感染細(xì)胞的影響。

一些針對GP1的抗體還可能通過補(bǔ)體成分C1q的抗體依賴性增強(qiáng)作用增強(qiáng)EBOV的感染。在感染初始階段，EBOV GP1與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，而C1q可增強(qiáng)病毒-抗體復(fù)合物與細(xì)胞表面的C1q配體之間的結(jié)合，從而促進(jìn)EBOV和其受體的相互作用。這種可增強(qiáng)病毒感染能力的抗體具有病毒特異性，且主要與免疫球蛋白IgG2a和IgM水平有關(guān)，與IgG1水平無關(guān)[23-24]。以GP為基礎(chǔ)制備的EBOV疫苗進(jìn)行主動免疫，或使用針對GP的抗體進(jìn)行被動預(yù)防或治療時，抗體增強(qiáng)病毒感染的現(xiàn)象給人們對疫苗的有效性帶來疑慮[25-26]。

2.4 其他方面 EBOV還通過影響其他途徑的體液和細(xì)胞免疫，從而逃逸宿主的免疫反應(yīng)[5,27]。病毒感染巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（主要的抗原提呈細(xì)胞）后，會導(dǎo)致大量T細(xì)胞（輔助性T細(xì)胞和毒性T細(xì)胞）和NK細(xì)胞的凋亡[10]，并抑制特異性抗體的產(chǎn)生[27]。

3 治療藥物作用機(jī)制

許多暴露后治療方法或預(yù)防策略都已被研究，主要集中在以下方面：直接抗病毒作用的藥物（可抑制病毒聚合酶的小分子、阻止病毒蛋白產(chǎn)生的寡核苷酸類、沉默病毒基因的小干擾RNAs）、可作用于病毒復(fù)制和傳播相關(guān)蛋白的化合物（可阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞的多離子通道抑制劑和腎上腺素受體拮抗劑、可控制晚期病毒進(jìn)入細(xì)胞的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、促進(jìn)宿主防御和調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)藥物（有凝血因子和細(xì)胞因子活性的化合物、多重干擾素、抗阿片肽）、單克隆或多克隆抗體、使用康復(fù)患者血漿進(jìn)行被動免疫、維持并重建患者的機(jī)體功能[28-30]。

以上藥物靶標(biāo)和治療策略均以EBOV致病機(jī)理或免疫逃逸機(jī)制為基礎(chǔ)開發(fā)的，例如，兩種抗體類藥物MB-003和Zmapp是針對GP的單克隆抗體混合物[31-32]。由加拿大Tekmira生物制藥公司研制的TKM-Ebola是一種siRNA化合物，專門針對EBOV的VP24和VP35基因。由日本富士公司制造的法匹拉韋（favipiravir，T-705）是一種聚合酶抑制劑，可抑制感染細(xì)胞內(nèi)病毒基因復(fù)制和病毒顆粒的釋放，防止病毒擴(kuò)散到其他未感染細(xì)胞。磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸（PMOs）是可滲透入細(xì)胞的核苷酸類似物，以VP24、VP35 mRNAs為靶標(biāo)[33]。廣譜的核苷酸類似物BCX4430可抑制病毒聚合酶活性，作為非專性的RNA鏈終結(jié)者[34]。腺苷類似物可能通過封閉S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶的活性，直接限制病毒mRNA 5′端甲基化[35]。

4 結(jié)語

關(guān)于EBOV的病原學(xué)、生物學(xué)和免疫學(xué)等特征已取得了重要的研究進(jìn)展，疫苗研制也進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但仍有許多科學(xué)問題尚不完全明確。同其它動物相比，EBOV對人類的致病性更強(qiáng)，而蝙蝠的免疫系統(tǒng)可阻止EBOV的致死性感染[36]。因此，研究蝙蝠體免疫系統(tǒng)阻止EBOV的免疫逃逸的機(jī)制很重要。VP24和VP35在干擾IFN活性方面的分子機(jī)制已被研究的較為詳盡，但分泌蛋白（如sGP、GP1、VP40）的功能也應(yīng)被研究清楚，特別是sGP在病毒的生命周期和對機(jī)體的致病性方面研究的不是很透徹。此外，雖然我們對EBOV病原學(xué)研究的較多，但對病毒的生態(tài)學(xué)仍較缺乏，而生態(tài)學(xué)可能與選擇壓力相關(guān)，影響著病毒的致病性和免疫逃逸策略。

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（收稿：2015-11-01 修回：2015-11-16 編校：丁艷玲）

R 512.8

A

2095-3496（2015）04-0203-04

國家“十二五”科技重大專項(xiàng)（重大新藥創(chuàng)制）（2015ZX09102025）

130122 吉林長春，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院十一所（楊松濤，高玉偉，王化磊，夏咸柱）；吉林長春，長春西諾生物科技有限公司（金宏麗）

王化磊，E-mai l：whl831125@163.com；夏咸柱，E-mai l：xiaxzh@cae.cn