李 甜 陳紅香 廖禮彬 馮樹梅 秦 紋 白生賓

（新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，烏魯木齊830011；1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院婦科，烏魯木齊830000；）

組織切片的化學(xué)染色有多種方法，其中蘇木精－伊紅染色（hematoxylin eosin staining，HE）是最常用的染色方法之一，但是HE染色也存在一些缺陷，例如染液配制步驟復(fù)雜、不適于現(xiàn)配現(xiàn)用等［1］。然而一些常用的特殊染色操作相對簡單，結(jié)果較為穩(wěn)定，可以彌補(bǔ)HE染色中的不足，特殊染色技術(shù)在組織切片觀察中起到了不可替代的作用。本實(shí)驗(yàn)采用阿利辛藍(lán)AB染色（Alcian Blue）、過碘酸雪夫氏反應(yīng)PAS染色（Periodic Acid Schiff）及洋紅三種染色方法，比較人結(jié)腸組織光鏡下的染色特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特征，以期為組織胚胎學(xué)的教學(xué)和學(xué)習(xí)提供教學(xué)資料，為病理學(xué)的診斷提供特殊染色基礎(chǔ)和參考。

材料和方法

1.材料

選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院送檢的正常的結(jié)腸組織，Carnoy氏固定液固定。

2.主要儀器

Leica切片機(jī)、貼片機(jī)和Olympus顯微鏡。

3.主要試劑

3.1 阿利辛藍(lán)染色液即用型套組（阿利辛藍(lán)染液1瓶20mL，核固紅染液1瓶20ml）：由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

3.2 過 碘 酸 溶 液：0.5g過 碘 酸（HIO4）溶 于100mL蒸餾水中，待溶解后置于4℃冰箱避光保存。

3.3 雪夫氏劑（Schiff試劑）：在三角燒杯內(nèi)加入蒸餾水500ml，煮沸后，在保持微沸的情況下，加入堿性品紅2.5g，并不斷搖動約5min（勿使之沸騰），使堿性品紅徹底溶解（溶解液為深紅色）。冷卻到50℃時，過濾，加入1N鹽酸50ml，再待冷卻至25℃時加入偏重亞硫酸鈉2.5g，塞住瓶口，搖動容器以充分混合（此時顏色明顯變淡），然后避光放置或冰箱內(nèi)24h，溶液為淡黃或淡紅色，再加入活性炭5g，混合后振蕩數(shù)分鐘，靜置1h，再用雙層濾紙過濾，此時溶液應(yīng)完全無色、清澈透明，為無色品紅。封口，貯存于棕色瓶中（最好外包黑紙避光）存放入4℃冰箱備用［2］。

3.4 偏重亞硫酸鈉：1N鹽酸7.5ml加10%偏重亞硫酸鈉7.5ml，再加130ml蒸餾水混合而成。

3.5 醋酸洋紅染液：將1000ml 45%醋酸水溶液煮沸，慢慢加入1g洋紅。冷卻后靜置6h，過濾入棕色瓶保存?zhèn)溆谩?/p>

4.方法

4.1 組織標(biāo)本取材固定包埋，結(jié)腸組織Carnoy氏固定液固定3h，進(jìn)入脫水劑100%酒精Ⅰ脫水2h、100%酒精Ⅱ脫水2h，進(jìn)入半苯半酒精和透明劑二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各2h直至包埋，在半苯半蠟浸蠟40min，蠟Ⅰ、蠟Ⅱ浸蠟各25min，包埋成蠟塊，切片厚6μm，貼片機(jī)38℃貼片，40℃溫箱烤片4天。

4.2 染色（1）結(jié)腸組織阿利辛藍(lán)AB染色：組織切片脫蠟后，阿利辛藍(lán)染液10－20min，蒸餾水沖洗；核固紅染液復(fù)染5－10min，蒸餾水沖洗；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。（2）結(jié)腸組織PAS染色：組織切片脫蠟后，至1%過碘酸中染色5min，蒸餾水沖洗，再至雪夫氏劑中染色5min，10%偏重亞硫酸鈉染色2min，入酒精常規(guī)封片。（3）結(jié)腸組織洋紅染色：組織切片脫蠟后，醋酸洋紅染液15min，蒸餾水沖洗。

結(jié) 果

從圖1中可見，三種染色方法均能對結(jié)腸組織進(jìn)行很好的染色，但是染色效果有所不同。

1.AB染色法顯示，結(jié)腸粘膜上皮吸收細(xì)胞細(xì)胞核染為紅色，杯狀細(xì)胞呈空泡狀，胞質(zhì)內(nèi)的粘液染為藍(lán)色；有許多密集排列的大腸腺，大腸腺腺腔內(nèi)染為藍(lán)色。

2.結(jié)腸組織PAS染色顯示，切片總體染色較淺，吸收細(xì)胞細(xì)胞核染為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染為淡粉色?？梢姳瓲罴?xì)胞呈空泡狀，胞質(zhì)內(nèi)黏液染色淡粉色。

3.結(jié)腸組織洋紅染色顯示：結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞核染為藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)染為紅色。杯狀細(xì)胞呈空泡狀，胞質(zhì)內(nèi)的粘液染為紅色。大腸腺腺腔內(nèi)染為紅色。

討 論

隨著醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，HE染色已經(jīng)不能夠滿足醫(yī)學(xué)形態(tài)學(xué)學(xué)科發(fā)展的需要，特殊染色越來越多地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)以及其他相關(guān)學(xué)科。特殊染色對于實(shí)驗(yàn)教學(xué)、組織的觀察研究、疾病診斷等方面起著舉足輕重的作用。其中阿利辛藍(lán)AB染色、過碘酸雪夫氏PAS染色及洋紅染色等這幾種染色是比較常用的特殊染色。由于其染色方法顯示不同的物質(zhì)，具有不同的染色效果，選取此三種染色進(jìn)行染色對比有利于觀察人結(jié)腸的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。阿利辛藍(lán)是顯示酸性黏多糖最特異的染料，根據(jù)組織化學(xué)的染色機(jī)理，阿利辛藍(lán)染色法可清楚顯示結(jié)腸組織內(nèi)的黏液基質(zhì)，彌補(bǔ)了HE染色在觀察黏液時的不足［3－4］。過碘酸雪夫氏PAS染色多用于糖原的鑒定和黏液的顯示，它是先采用過碘酸（HIO4）氧化使乙二醇基變?yōu)橐叶┗?，醛可以與雪夫氏劑相結(jié)合，生成紅色的反應(yīng)物。PAS呈陽性反應(yīng)的物質(zhì)主要有多糖，中性粘多糖、黏蛋白及糖蛋白。人結(jié)腸粘膜上皮杯狀細(xì)胞頂部膨大，內(nèi)含大量的黏原顆粒，化學(xué)分析表明，此黏液主要由分子量巨大的糖蛋白構(gòu)成，其分子末端富含唾液酸和硫酸酯類等酸性糖鏈，可用阿利辛藍(lán)染色顯示，PAS反應(yīng)強(qiáng)陽性［5］。

雖然三種染色方法均能不同程度地顯示出人結(jié)腸的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。但是，從本實(shí)驗(yàn)染色上，從不同的角度呈現(xiàn)了結(jié)腸組織的3種不同染色劑的染色效果，綜合3種染色結(jié)果：三種染色都能清晰顯示結(jié)腸組織的輪廓，阿利辛藍(lán)AB染色使吸收細(xì)胞的細(xì)胞核染為紅色，杯狀細(xì)胞黏液染為藍(lán)紫色；洋紅染色使吸收細(xì)胞的細(xì)胞核染為藍(lán)紫色，杯狀細(xì)胞黏液染為紅色。PAS能清晰顯示結(jié)腸組織的細(xì)胞及細(xì)胞核輪廓，可見杯狀細(xì)胞呈空泡狀，未出現(xiàn)PAS反應(yīng)強(qiáng)陽性，胞質(zhì)內(nèi)黏液染色較淺［5］。PAS染色效果不穩(wěn)定，往往著色很淺或不顯色，可能與過碘酸的濃度或者處理時間因素有關(guān)［6］。與人結(jié)腸組織HE染色切片作對比，HE染色以伊紅染細(xì)胞質(zhì)，以蘇木素染細(xì)胞核，著色均勻，能清晰呈現(xiàn)細(xì)胞輪廓，但對結(jié)腸杯狀細(xì)胞黏液無法顯示。阿利辛藍(lán)和洋紅染色使用簡易，試劑配制簡單，現(xiàn)配現(xiàn)用，染色方法也簡單，能清楚顯示杯狀細(xì)胞的黏液，并呈現(xiàn)出顏色互補(bǔ)，對比明顯。這為組織胚胎學(xué)與病理學(xué)的教學(xué)提供較為豐富的資料，并為病理學(xué)的診斷和鑒別診斷提供一定的基礎(chǔ)。特殊染色方法的廣泛應(yīng)用為臨床病理診斷和病理學(xué)、組織學(xué)的教學(xué)和研究打下堅實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］張祥令，陳騰祥，臧貴勇等.組織切片 PT和 HE、PAS、PASH、PAST染色方法的比較.貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，36（3）：319－320

［2］付銀峰.PAS染色方法及應(yīng)用.河南科技大學(xué)學(xué)報，2008，26（2）：100－101

［3］董妙珠、肖萍、葉于薇等.PAS、AB染色法在軟骨黏多糖檢測中的應(yīng)用.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2004，16（9）：419－420

［4］鄧振旭，楚德昌.消化道組織塊黏液細(xì)胞的組織化學(xué)染色.生物技術(shù)，2007，17（6）：42－43

［5］成令忠，鐘翠平，蔡文琴.現(xiàn)代組織學(xué)，上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2003，799－805

［6］郭效忠，劉春榮.過碘酸－Schiff（PAS）染色方法的幾處調(diào)整和改進(jìn).診斷病理學(xué)雜志，2013，20（7）：448