方美蓉，劉海軍，劉可越

(九江學(xué)院，江西 九江 332000)

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植物黃酮分離純化研究進(jìn)展

方美蓉，劉海軍，劉可越*

(九江學(xué)院，江西 九江 332000)

綜述了植物黃酮分離純化的常用方法，包括傳統(tǒng)柱層析(薄層層析)法、 金屬離子絡(luò)合法、 膜分離法、高效毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、高效逆流色譜法、高速離心分離技術(shù)、 聚酰胺樹脂法以及大孔吸附樹脂法。簡要分析了各方法的優(yōu)缺點(diǎn)和應(yīng)用前景，為進(jìn)一步深入研究植物黃酮的分離純化提供參考。

植物黃酮；分離；純化；研究進(jìn)展

黃酮類化合物是一類存在于自然界中具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物。絕大部分植物都含有黃酮類化合物。黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、抑制脂肪酶、抗菌、消炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿等作用[1]。其由2個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子互相連接而成的，常含酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團(tuán)，提取方法常采用有機(jī)溶劑提取法(甲醇、乙醇)、超聲輔助雙水相萃取法；純化常采用柱層析法、色譜法及大孔吸附樹脂法。本文就黃酮類化合物的分離純化方法進(jìn)行介紹。

1 傳統(tǒng)柱層析法

柱層析法具有分離效果好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，是一種傳統(tǒng)的分離方法。余丹妮等[2]為建立益母草總黃酮含量測定方法，在運(yùn)用聚酰胺柱分離純化樣品后，以三氯化鋁試劑為顯色劑，蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法測定蘆丁在412nm波長處的吸光度，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，發(fā)現(xiàn)蘆丁在4.8～29.0μg/mL范圍內(nèi)與吸光度有良好線性關(guān)系,r=0.999 6,回收實(shí)驗(yàn)中，平均回收率為102%,RSD=3%。由此得出結(jié)論：柱層析—分光光度法操作簡單，準(zhǔn)確可靠，可作為益母草藥材的含量測定方法?，F(xiàn)今較少使用此類方法進(jìn)行黃酮的純化，而多見于其優(yōu)化工藝。李欣欣等[3]通過使用戊二醛交聯(lián)膠原纖維吸附劑(CFA)，對兩種結(jié)構(gòu)相近的單糖基黃酮苷類化合物(染料木苷和黃芪苷)進(jìn)行柱層析，并測定此種吸附劑的分離性能，發(fā)現(xiàn)改變乙醇水溶液的溶度可調(diào)節(jié)CFA對染料木苷和黃芪苷的吸附選擇性：CFA的用量為6g，層析柱的徑比為10∶1時，100%、 90%和70%乙醇水溶液進(jìn)行分步洗脫，兩者可分離，純度分別為98%、97%。此方法操作簡單，但洗脫過程繁瑣耗時，尤其是使用硅膠層析柱時要避免金屬離子干擾。

2 金屬離子絡(luò)合純化法

此方法是利用黃酮類化合物具有超離域度，即黃酮類化合物的母核是由 3 個環(huán)組成，2個苯環(huán)，1個吡喃環(huán)，大多數(shù)含有羥基或羰基，此結(jié)構(gòu)具有超離域度[4]，整個分子為一個大π鍵共軛體系,氧原子具強(qiáng)配位能力，與金屬離子及稀土元素形成配合物后，再由解絡(luò)合劑達(dá)到純化目的。隨著對它研究的深入，發(fā)現(xiàn)此類方法用于黃酮的純化簡便且有效。董艷輝[5]研究了金屬絡(luò)合法純化火炭母黃酮的工藝，通過單因素實(shí)驗(yàn)對 4 種不同金屬鹽與火炭母黃酮的絡(luò)合效果進(jìn)行了比較，篩選出最佳絡(luò)合金屬鹽為氯化鈣，同時在反應(yīng)液的pH為8.0、氯化鈣溶液濃度為6.0mmol/L、黃酮濃度為0.2mg/mL、解絡(luò)劑EDTA與絡(luò)合劑CaCl2的摩爾比為1.5∶1的純化條件下，黃酮含量由粗提物的20.5%提高到56.5%，提高了2.8倍。由此證明此法純化火炭母黃酮簡便有效。此類方法主要適用于含鄰二羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物的分離純化，專屬性強(qiáng)，但其解絡(luò)合比較困難。

3 膜分離法

膜分離技術(shù)是一種利用待分離物中各物質(zhì)分子量的大小不同，膜的選擇滲透性作用，在壓力差推動下分離純化的方法。它是一種工藝簡單，純化效率較高的方法，主要用于分子大小差別較大黃酮類物質(zhì)的純化，易克傳等[6]運(yùn)用此法以菊花總黃酮純度和操作過程穩(wěn)定性為評價指標(biāo)研究純化菊花總黃酮工藝，采用膜分離技術(shù)對菊花提取液進(jìn)行處理，對膜的規(guī)格、溶液溫度、操作壓力和操作時間進(jìn)行了優(yōu)選，得最佳工藝參數(shù)下：陶瓷膜，孔徑0.5μm，溶液溫度50℃、操作壓力0.25MPa;超濾膜，截留分子量為8×103，溶液溫度40℃、操作壓力1.60MPa總黃酮純度達(dá)19.8%。同時采用陶瓷膜進(jìn)行微濾預(yù)處理，去除了大量大分子物質(zhì)，減輕了濃差極化和凝膠層阻隔作用，超濾過程較為穩(wěn)定。由這兩項(xiàng)得出結(jié)論：采用膜技術(shù)純化菊花總黃酮工藝操作簡單，純化效果好。此類方法特別適用于熱敏性化合物，具有節(jié)能等特點(diǎn)，但對于分子量相差不大、結(jié)構(gòu)相似的黃酮類化合物不適用。

4 高效毛細(xì)管電泳

高效毛細(xì)管電泳法是一種在電場驅(qū)動下,以毛細(xì)管為分離通道按待分離物分配系數(shù)的不同而進(jìn)行液相分離的技術(shù)。其在分析、分離等方面的應(yīng)用相比其他色譜方法更有優(yōu)勢，如高靈敏度、高速、樣品耗用量少、重現(xiàn)性好、自動化等，這對長期生長于強(qiáng)輻射、日照時間長的環(huán)境下，具有有效成分含量高、生物活性強(qiáng)等優(yōu)勢的我國特有的高原植物西北中藏藥中黃酮類化合物的分析研究具有重要意義[7]。此類方法分離效能高，分離速度快，但對儀器要求高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)的黃酮類化合物的分離純化。周一鳴[8]等為建立一種高效毛細(xì)管電泳(HPCE)法測定黃酮類化合物含量的方法，以蕎麥芽粉為原料，通過預(yù)試驗(yàn)，確定在20mmol/L硼砂-硼酸溶液(pH8.4)電泳緩沖液中，25℃、20kV 壓力條件下進(jìn)行電泳，在245nm 波長處同時檢測分離的槲皮素和蘆丁方法，發(fā)現(xiàn)所測結(jié)果與被測物質(zhì)質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系，在10min 內(nèi)黃酮類化合物完全分離， 符合定性研究和定量測定的要求，由此建立測定蕎麥芽粉中蘆丁、槲皮素黃酮類化合物含量的高效毛細(xì)管電泳法，為實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確測定植物樣品中黃酮類化合物含量提供了一種新方法。

5 高效液相色譜法

早期，此方法較紙色譜、柱色譜、薄層色譜的分離效果更理想,但考慮到其分離成本較高,更多用于黃酮類化合物的定性檢測、定量分析或少量樣品的制備等[9]。彭禮軍等[10]以天麻提取物為原料，采用硅膠柱層析和制備型高效液相色譜建立了分離純化天麻素單體的制備工藝。先用柱層析對原料進(jìn)行純化得天麻素粗品，再進(jìn)行分析型高效液相色譜考察流動相的組成、流速和上樣量等對分離效果進(jìn)行考察，通過將分析型高效液相色譜條件線性放大，確定制備型高效液相色譜條件：流動相為乙腈—水5∶95( V/V) ，流速為15mL/min，上樣量為45mg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)天麻素純度達(dá)到99%以上。最后得出結(jié)論：較之目前常用的天麻素純化方法，本研究方法能較方便地制備出高純度(99% 以上)天麻素，但因本方法難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用且在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)天麻素不穩(wěn)定的現(xiàn)象，所以有待進(jìn)一步研究。此類方法分離效能好，但成本較高，所以不常用于分離純化。

6 高速逆流色譜法

高速逆流色譜( HSCCC) 是一種無需載體或固體支撐物，利用待分離物分配系數(shù)差異的液-液分配色譜分離方法，常用于天然藥物的分離純化。尹鷺等[11]應(yīng)用高效逆流色譜法分離純化了化橘紅中2種黃酮類化合物：運(yùn)用高效逆流色譜分析柱分離純化，發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶4∶5，V/V)為兩相溶劑系統(tǒng)，可從1g粗提物中1次分離得到純度大于98%的柚皮苷單體83.3mg。以二氯甲烷-甲醇-水(10∶7∶4，V/V)和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1，V/V)為溶劑系統(tǒng)，可從1g粗提物的酸解物中經(jīng)2次分離得到純度大于98%的柚皮素單體27.5mg，且兩種物質(zhì)分離時間均在60min內(nèi)，從而得出結(jié)論該法簡便、快速、制備量大，可用于化橘紅中黃酮類化合物的快速分離制備。此類方法因未使用固體載體，避免了色譜中的不可逆吸附，可較好分離出天然藥物中的單體，并達(dá)到較高純度，所以對儀器要求高。

7 高速離心分離技術(shù)

高速離心分離技術(shù)是在離心機(jī)高速運(yùn)轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力下,利用待分離物與周圍介質(zhì)密度差異使物質(zhì)沉降或懸浮而達(dá)到分離的目的。此法尤其適用于固液相的分離，也是工業(yè)化生產(chǎn)的理想選擇，同時因?yàn)槲锢矸椒ǖ倪\(yùn)用，也就避免了化學(xué)吸附帶來的有效成分損失。潘廖明[12]通過正交試驗(yàn)優(yōu)化離心法純化大豆異黃酮的條件:大豆異黃酮樣液濃度為20mg/mL,溶解溫度為40℃,離心速度為2×103r/min,離心時間為30min的優(yōu)化條件下,大豆異黃酮含量可由40.9%提高到71.2%,達(dá)到了進(jìn)一步提高大豆異黃酮含量,滿足其精細(xì)化需要的目的。此類方法主要依據(jù)化合物分子大小差異達(dá)到分離的目的，所以對于小分子化合物不適用。

8 聚酰胺樹脂純化法

聚酰胺樹脂純化法是利用聚酰胺樹脂中的酰胺基與黃酮類化合物中的羥基通過氫鍵結(jié)合，由洗脫劑洗脫達(dá)到分離純化的目的。近年來，聚酰胺樹脂已廣泛應(yīng)用于中藥及其復(fù)方有效部位或有效成分的分離純化，且對黃酮類、酚類、醌類等成分的純化比其他方法優(yōu)越，具有可逆、分離效果好等特點(diǎn)[13]。司建志等[14]在用聚酰胺樹脂純化八角渣黃酮試驗(yàn)中，先通過靜態(tài)解吸附實(shí)驗(yàn)，確定了純化八角殘渣黃酮的聚酰胺樹脂目數(shù)：30～60目，然后采用單因素與正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化吸附條件，動態(tài)解析實(shí)驗(yàn)優(yōu)化解析條件,在最佳工藝：上柱液濃度為0.05g/mL(生藥量)，上柱液pH為5，層析柱高度與內(nèi)徑的比值為12∶1，上柱液流速為1～2BV/h，飽和吸附量為150.06mg/g。4BV體積的90%乙醇沖洗樹脂柱，解析率為70.77%物質(zhì)中黃酮的純度達(dá)87.5% 。以聚酰胺樹脂對八角殘渣黃酮的吸附量及解析率為指標(biāo)證明聚酰胺樹脂能有效純化八角渣黃酮，且最終所得的黃酮純度高，適于工業(yè)化生產(chǎn)。此類方法專屬性較強(qiáng)，可與黃酮類化合物形成可逆吸附，但其吸附過程易受溶劑影響。

9 大孔吸附樹脂純化法

大孔吸附樹脂法是利用吸附樹脂對物質(zhì)吸附差異，運(yùn)用解吸劑進(jìn)行純化的方法，也是一種適合大規(guī)模生產(chǎn)的方法。最近研究多集中于從多種樹脂中選出最適大孔樹脂對含黃酮植物進(jìn)行純化。莫天錄等[15]通過比較 10 種大孔吸附樹脂純化黃酮粗提取物的吸附及解吸性能，篩選出純化XDA-1樹脂并進(jìn)一步考察了XDA-1樹脂對黃酮粗提取物的靜態(tài)、動態(tài)吸附與解吸的性能，得到XDA-1 樹脂純化綠茄葉黃酮粗提取的最佳工藝參數(shù):吸附平衡時間8h，吸附濃度為2.00mg/mL，pH值3.0，溫度25℃,上樣流速2BV/h;解吸平衡時間2h，解吸劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，pH值3.0，解吸流速3BV/h。此條件下的純化物浸膏中黃酮質(zhì)量濃度為5.68mg/mL，純化倍數(shù)為2.37。證實(shí)大孔吸附樹脂純化綠茄葉黃酮方法簡單可行，為綠茄葉黃酮的分離純化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此類方法具有操作簡便、理化性質(zhì)穩(wěn)定、不溶于酸堿及有機(jī)溶劑中、能較好保持化合物原本活性以及對有機(jī)物有較好選擇性等優(yōu)點(diǎn)，但在使用時其分離效能受吸附劑性能、洗脫劑種類、溫度等的影響。

植物黃酮具有較多生理作用，所以有較多對它的分離純化研究方法，且日益成熟并在不斷完善。目前研究主要集中在現(xiàn)有方法基礎(chǔ)上，對它的工藝條件優(yōu)化；對色譜法中吸附材料的優(yōu)選；對兩種提取分離方法的合并聯(lián)用，預(yù)期提高純化效率。在后來的不斷研究中，通過新的有機(jī)分子材料發(fā)現(xiàn)，儀器的更新，以及某類藥物專有方法的使用，黃酮的分離純化可以達(dá)到更高的效率。對于一些正在發(fā)展中的方法如高速逆流色譜法、大孔吸附樹脂法以及高效毛細(xì)管電泳法具有純化純度高、雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，具有很好的研究應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2015-09-24

江西省科技支撐計劃項(xiàng)目(20141BBG70084)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20122BAB205074)

方美蓉(1993-)，女，九江學(xué)院在讀生，研究方向?yàn)橹兴幪烊划a(chǎn)物。

劉可越(1978-)，女，博士，九江學(xué)院教授，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：liukeyue2011@126.com

R282.71

A

1673-2197(2015)21-0061-02

10.11954/ytctyy.201521026