王芳芳, 譚風雷,姜 陽，馬小茹，劉 蕾,劉君星, 梁衍鋒, 吳佳梅,王淑湘,王淑秋

(1.佳木斯大學基礎醫(yī)學院 ，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學臨床醫(yī)學院 ，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

戊四氮誘導癲癇大鼠腦N-cadherins和NT-4的變化及靈芝酸的干預作用①

王芳芳1, 譚風雷2,姜 陽3，馬小茹1，劉 蕾1,劉君星1, 梁衍鋒1, 吳佳梅1,王淑湘1,王淑秋

(1.佳木斯大學基礎醫(yī)學院 ，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學臨床醫(yī)學院 ，黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：觀察戊四氮(PTZ)誘導大鼠癲癇后腦神經型鈣粘附素(N-cadherins)和神經營養(yǎng)因子-4(NT-4)變化及應用靈芝酸進行干預與治療，主要研究靈芝酸預防和治療癲癇的癇性發(fā)作的機理。方法：采用健康的雄性Wistar實驗大白鼠33只，按隨機分配原則分成正常對照組、癲癇模型組和靈芝酸治療組每組11只。癲癇模型組與靈芝酸治療組均采用誘導癲癇亞驚厥發(fā)作劑量腹腔注射戊四氮制備Wistar大白鼠慢性點燃癇性模型。在實驗室冰盒低溫條件下迅速提取大鼠腦組織，采用Western-Blotting方法檢測大鼠腦N-cadherins和NT-4的變化。結果：實驗性誘導癲癇大鼠癇性模型制備成功，靈芝酸治療組和癲癇模型組實驗動物都達到癲癇點燃的實驗標準，與癲癇模型組動物相比，靈芝酸組大鼠潛伏期明顯延長，但持續(xù)時間之間的差別沒有顯著性。實驗檢測Western-Blotting結果發(fā)現(xiàn)：PTZ誘導癲癇發(fā)作后N-cadherins蛋白表達水平明顯高于正常對照組，差異有顯著性 (P<0.01)；用靈芝酸干預后，N-cadherins的表達有明顯下降，差異有顯著性 (P<0.01)，癲癇模型組大鼠腦NT-4蛋白含量比正常對照組蛋白含量升高，差異具顯著性(P<0.05)；靈芝酸組大鼠腦NT-4蛋白含量較癲癇模型組蛋白含量升高，差異具顯著性(P<0.05)。結論：靈芝酸作用癲癇大鼠后N-cadherins蛋白表達降低，調整機體病變神經元的興奮性，靈芝酸還能夠增強NT-4的表達從而減輕癲癇發(fā)作給神經系統(tǒng)造成的損傷，從而起到抗癲癇作用。

癲癇；戊四氮；N-cadherins；NT-4；靈芝酸

癲癇(epilepsy,EP)是一種神經系統(tǒng)功能紊亂現(xiàn)象[1,2]，是中樞神經系統(tǒng)功能疾病，其僅低于腦血管疾病的第二大頑故病癥，對人類的健康產生嚴重威脅。據WHO2001 的有關數(shù)據顯示，全世界約有 1%的人經受著癲癇疾病的困擾(WHO2001)，至今癲癇的治療及防護主要還是通過藥物為主導，但癲癇治療與預防的藥物發(fā)展速度相當遲緩。神經型鈣粘附素(N-Cadherin)是最早在鈣粘附素家族中樞神經系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的有效成員之一[3]，中樞神經系統(tǒng)神經突觸形成在研究發(fā)現(xiàn)其與軸突生長起著至關重要的作用。神經營養(yǎng)因子4(neurotrophin-4，NT-4)實驗研究發(fā)現(xiàn)其具有促進神經元的分化、生長與成熟，有效維持神經元的存活有很重要的功效，又驗證其可以通過促進腦神經損傷后的修復與再生研究方面發(fā)揮著明顯的效用[3]。靈芝酸(GanodermaAcid，GA) 是靈芝的主要成分之一，至今為止從分離赤芝占有很高的比例， 目前研究不同種類靈芝中分離到的三萜類化合物已達百種以上[4]。靈芝酸有良好的生物活性[5]，①抗腫瘤②抗高血壓③降血脂④抗炎癥反應⑤免疫調節(jié)⑥促進智力和延緩衰老。但是由于種類的繁多，針對靈芝酸各單獨化合物具體實際藥理作用并未完全認定。本研究即探討靈芝酸干預戊四氮誘導大鼠癲癇腦組織N-cadherins和NT-4的含量變化,闡明靈芝酸抗癲癇作用。

1 材料和方法

1.1 主要實驗試劑與儀器

戊四氮 網上訂購美國的Sigma公司；(兔抗大鼠)的N-cadherins多克隆抗體、(兔抗大鼠)的NT-4多克隆抗體和簡裝PBS緩沖液試劑，均網上采購于武漢博士德生物工程有限公司；SABC試劑盒，購于武漢博士德生物工程有限公司。EPS-100電泳儀，購于上海天能科技有限公司制造；GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)，購于上海天能科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備和實驗后動物的處理

選取實驗用健康雄性Wistar大鼠33只，體重171～205g，由大連醫(yī)學院動物實驗中心提供。按隨機分配原則將實驗大鼠分成3組：分別為正常對照組、戊四氮誘導癲癇模型組和靈芝酸干預治療組，每實驗組11只大鼠。實驗參考Morgan等[6]的方法但做了相應的改動。用新鮮生理鹽水與PTZ完全溶解配制成注射濃度為10g/L的溶液。分別給予致亞驚厥劑量PTZ(35mg/kg)腹腔注射至靈芝酸治療組和癲癇模型組，每日給藥1次，持續(xù)注射28d；正常對照組實驗大鼠采用等容新鮮生理鹽水代替戊四氮腹腔注射。靈芝酸組腹腔注射PTZ的同時再經灌胃一定濃度靈芝酸溶液，每日給藥1次，連續(xù)給藥28d；癲癇模型組實驗大鼠與正常對照組實驗大鼠同時經灌胃給予同體積新鮮生理鹽水。停藥7d后，再給等同劑量的PTZ進行點燃測試癲癇[7]。

1.2.2 觀察實驗大鼠在行為上變化

實驗大鼠癲癇發(fā)作評價給分標準[3,8,9]：0級，在行為上無顯著發(fā)作反應；Ⅰ級，出現(xiàn)規(guī)律性點頭或頭面部有抽動；Ⅱ級，會有點頭甩尾或伴有陣攣性咀嚼；Ⅲ級，頭部出現(xiàn)顫搐并伴隨著前肢陣攣性抽搐；Ⅳ級： 出現(xiàn)站立袋鼠樣姿勢和或伴隨多肢抽動；Ⅴ級，發(fā)生全面多發(fā)性持續(xù)強直-陣攣性發(fā)作。實驗中每日對注射PTZ后每只大鼠監(jiān)測15～55min，記錄本隨時跟蹤記錄癲癇發(fā)作的級別、癲癇發(fā)病的潛伏期(s)和癲癇發(fā)病癇性發(fā)作持續(xù)時間(s)，凡持續(xù)發(fā)生5dⅡ級以上癲癇癇性發(fā)作的實驗大鼠都可定為復制成功標準[3]。

1.2.3Western-Blotting檢測

實驗室內低溫冰盒條件下取實驗動物海馬組織，快速電子稱稱重后，迅速勻漿。低溫冰盒4℃條件下裂解30min，4℃離心機設置12000r/min狀態(tài)下離心15～20min，吸取上清液分裝；用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測實驗定樣品蛋白的表達；在低溫冰水混合物的條件下轉膜1h；反復用常溫TBST液漂洗3次；進行封閉孵育1h置于室溫37℃條件平緩搖床內；再用常溫TBST液反復沖洗3遍；加入Ⅰ抗低溫4℃條件孵育過夜；反復用常溫TBST液沖洗3遍后；加入Ⅱ抗室溫37℃條件下置于平緩搖床搖動孵育1h；再常溫TBST反復沖洗3遍[3,7]。吸干后用顯色用BCIP-NBT顯色劑。最后用GIS凝膠圖像處理實驗數(shù)據系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSSforWindows11.5統(tǒng)計軟件，數(shù)據均用平均數(shù)±標準差表示，動物實驗各組間的處理比較用t檢驗方法。

2 結果

2.1 行為學觀察

正常對照組變化無明顯差異。靈芝酸治療組和癲癇模型組均發(fā)生持續(xù)多次的癲癇的癇性發(fā)作，其級別在Ⅱ～Ⅴ級，實驗動物均達到癲癇的癇性點燃標準[3，7]，該實驗研究的兩組動物按有關文獻報道達到制備癲癇模型成功。

2.2 大鼠腦組織N-cadherins和NT-4蛋白表達含量變化

通過實驗檢測Western-Blotting蛋白表達情況，癲癇癇性發(fā)作后N-cadherins蛋白表達與對照組蛋白表達相比較升高較明顯，其表達差異具有顯著性 (P<0.01) ；給予靈芝酸干預后，N-cadherins的蛋白表達有明顯下降趨勢，其表達差異具顯著性(P<0.01) 。癲癇發(fā)作后NT-4蛋白表達比對照組蛋白表達明顯升高，差異有顯著性(P<0.05) ；給予靈芝酸干預后，NT-4蛋白表達比癲癇組蛋白表達明顯升高，其差異具顯著性(P<0.05)。見圖1。

圖1 N-cadherins和NT-4蛋白含量的變化(Western blotting)

*與對照組相比P<0.05;**與對照組相比P<0.01；#與癲癇模型組相比P<0.05 ；##與癲癇模型組相比P<0.01。

3 討論

戊四氮(PTZ)誘導慢性點燃癲癇動物模型已經獲得公認[9]，是一種非常經典的致癇藥劑，NT-4不僅對神經元有促進存活、生長和分化作用，同時對保護腦神經元抵抗各種代謝損傷和毒素興奮性起著決定性作用。在實驗中Royo等[3，10]確認NT-4在動物外傷性中腦損傷的治療功效，并報道NT-4能有效的抑制大量海馬神經元的凋亡。證明NT-4對癲癇發(fā)作及創(chuàng)傷性腦損傷等有神經變性的臨床常見疾病中起著至關重要的調控作用[3，11]。鈣黏附素是一類介導鈣離子依賴的細胞與細胞黏附的細胞表面蛋白。神經元型鈣黏素做為鈣黏素家族中的重要成員之一，在應用海人藻酸(KA)誘導的驚厥模型中的表達發(fā)現(xiàn)，N-Cadherin蛋白在存活神經元中的表達明顯增高[3，11，12]。在本次實驗研究中我們發(fā)現(xiàn)靈芝酸干預組的癲癇的癇性發(fā)作級別較癲癇模型組發(fā)作級別有所降低，其發(fā)作時間較癲癇模型組有所縮短，動物實驗證明了靈芝酸干預后對癲癇的癇性發(fā)作有較好的控制和治療效果。實驗結果表明，癲癇癇性發(fā)作以后采用靈芝酸干預不但能有效抑制N-cad-herin蛋白表達含量升高，還有效的促進增強NT-4的蛋白表達含量。因此我們推測靈芝酸對癲癇發(fā)作既有預防作用，又有治療作用。靈芝酸作為靈芝孢子的有效成份之一[13]，其實驗結果與靈芝孢子對抑制N-cadherin的升高，促進NT-4的表達的實驗結果相一致，但具體機制仍需進一步的研究。因此靈芝酸作為探尋低毒高效防治癲癇的臨床用藥開辟出最新的研究思路和實驗科學依據。

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黑龍江省衛(wèi)生廳課題，編號： 2011-437；2014年佳木斯大學大學生科技創(chuàng)新項目，編號：XSYD2014-012；2014年黑龍江省佳木斯大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃立項，編號：201410222026；佳木斯大學科技創(chuàng)新團隊重點培育項目資助，編號：Cxtd-2013-04。

王芳芳(1975～)女，黑龍江佳木斯人，在讀博士研究生。

王淑秋(1957～)女，黑龍江穆棱人，碩士，教授，碩士研究生導師。E-mail：wang_shuq@163.com。

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1008-0104(2015)04-0133-02

2015-03-16)