陳效忠，常 鑫，呂紅梅，張 艷

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.呼和浩特市衛(wèi)生學(xué)校，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

水飛薊莖葉中具有抗氧化活性的黃酮類(lèi)化學(xué)成分研究①

陳效忠1，常 鑫2，呂紅梅1，張 艷1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.呼和浩特市衛(wèi)生學(xué)校，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

目的：通過(guò)已經(jīng)建立并且行之有效的化學(xué)篩選(LC-MSn)和活性篩選集成系統(tǒng)獲取水飛薊莖葉中具有抗氧化活性的黃酮類(lèi)化合物。方法：95%乙醇提取藥材獲得總提取物，D101型大孔樹(shù)脂富集總黃酮類(lèi)化合物，多種色譜方法(sephadex-LH20, HPLC等)相結(jié)合分離得到目標(biāo)化合物，NMR譜鑒定化合物結(jié)構(gòu)；采用Fe2+半胱氨酸誘導(dǎo)的肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化模型進(jìn)行化合物抗氧化活性篩選。結(jié)果：從水飛薊莖葉中首次分離得到5個(gè)黃酮類(lèi)化合物，這5個(gè)化合物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，IC50值 8.5～11.2。結(jié)論：從水飛薊莖葉中獲取的黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性，我們將進(jìn)一步研究抗氧化活性與臨床治療相關(guān)疾病的關(guān)系。

水飛薊；黃酮；抗氧化

水飛薊(Silybum marianumL.Gaertn)是菊科水飛薊屬植物，原產(chǎn)南歐、北非[1]。我國(guó)在20世紀(jì)50年代初引種了水飛薊用于觀賞花卉。20世紀(jì)60年代末以H. Wagner為代表的德國(guó)藥學(xué)家對(duì)其有效成分進(jìn)行提取后，我國(guó)才將它作為一種保肝藥用植物推廣種植。該植物主要在黑龍江、陜西、甘肅、河北等省栽培。水飛薊有效成分在果實(shí)內(nèi)，水飛薊的干燥果實(shí)經(jīng)提取、精制而得到的有效成分稱(chēng)為水飛薊素(Silymarin)，主要包括水飛薊賓(silybin)、異水飛薊賓(isosilybin)、水飛薊寧(silydianin)、水飛薊亭(silychristin)、脫氫水飛薊賓(dehydrosi-Silybin)、聚水飛薊賓(Silybinomer)等木脂素黃酮類(lèi)化合物[2]。以往研究主要集中在水飛薊果實(shí)，對(duì)莖葉研究極少。為了進(jìn)一步從水飛薊莖葉中獲取黃酮類(lèi)成分, 采用多種色譜法從大孔樹(shù)脂50%乙醇洗脫部位分離并鑒定了5個(gè)黃酮類(lèi)化合物，這5個(gè)化合物均具有較強(qiáng)的抑制Fe2+半胱氨酸誘導(dǎo)的肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化作用。

1 儀器、色譜填料、試劑與藥材

質(zhì)譜：Agilent 1100系列LC/MSD Trap-SL型液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定ESI-MS；核磁共振譜：BRUKER AV500-III核磁共振儀, 溶劑峰為內(nèi)標(biāo); 分析型HPLC：Agilent 1100 Series 液相色譜儀：DAD-UV檢測(cè)器; YMC C-18(150×4.6mm, 5μm), Diamonsil C18(250×4.6 mm,5μm); 制備型HPLC：Shimadazu LC-6AD, SPD-6A, SPD-10A 紫外檢測(cè)器,SPD紫外檢測(cè)器;YMC-Pack ODS-A(250×20 mm,10μm);中壓制備液相：美國(guó)Biotage公司FLASH。薄層色譜硅膠GF254及柱色譜用硅膠(100～200目,200～300目), 均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；反相柱色譜硅膠RP-18(50μm), 日本YMC 公司生產(chǎn)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20為Amersham Pharmacia Biotech AB生產(chǎn)；大孔樹(shù)脂D101型, 天津南開(kāi)聚酰胺(30～60目)；水為市售去離子水,HPLC用娃哈哈純凈水, 屈臣氏純凈水所用分析純?cè)噭楸本┗S生產(chǎn)。色譜溶劑：Dikma為美國(guó)Tedia公司生產(chǎn);Fisher為美國(guó)Fisher公司生產(chǎn)；顯色劑：10 % 硫酸乙醇溶液。藥材經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院陳效忠副教授鑒定為水飛薊(Silybum marianumL.Gaertn)。

2 提取與分離

95%乙醇提取水飛薊莖葉(30 kg), 得到浸膏(1.0kg), 浸膏經(jīng)D101型大孔樹(shù)脂，分別用蒸餾水，30%，50%，90%乙醇洗脫，50%洗脫部分經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜，甲醇-水(10:1～100:0)洗脫, 得到S1～S15組分，LC-MSn檢測(cè)含有黃酮組分為S5和S8，S5用制備型HPLC分離純化得到化合物1(10 mg), 2(8 mg)和3 (7 mg), S8用制備型HPLC分離純化得到化合物4 (12 mg) 和5 (15mg)。

3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，黃色粉末, HCl-Mg反應(yīng)陽(yáng)性, FeCl3反應(yīng)陽(yáng)性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ): δ 6.32 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6)，6.45 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 7.75 (2H, d, J=8.5 Hz，H-2'和H-6')，6.90 (2H, d, J=8.5 Hz，H-3'和H-5')，5.32 (1H, br.s, H-1'')，3.10-4.00 (4H, m, 2''-5''), 0.85 (3H, d, J=5.7Hz, H-6'') ; 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ156.9 (C-2), 135.0 (C-3), 180.0 (C-4), 162.0 (C-5), 99.2 (C-6), 165.0 (C-7), 94.1 (C-8), 158.2 (C-9), 104.7 (C-10), 121.0 (C-1'), 131.0 (C-2'和C-6'), 115.7 (C-3'和C-5'), 160.5 (C-4'), 102.0 (C-1''), 71.0 (C-2''), 71.2 (C-3''), 71.8 (C-4''), 70.3 (C-5''), 17.6(C-6'')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3]報(bào)道一致，故鑒定化合物為山奈酚-3-O-α-L-鼠李糖苷(圖1)。

化合物2，黃色粉末, HCl-Mg 反應(yīng)陽(yáng)性, FeCl3反應(yīng)陽(yáng)性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ): δ 6.42(1H, d, J=2.0 Hz, H-6)，6.85(1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 8.10(2H, d, J=8.5 Hz，H-2'和H-6')，6.95(2H, d, J=8.5 Hz, H-3'和H-5')，5.55(1H, br.s, H-1'')，3.10-4.00 (4H, m, 2''-5''), 1.10(3H, d, J=5.7Hz, H-6'') ; 13C-NMR(CDCl3,125 MHz):δ147.9 (C-2), 136.0(C-3),177.0(C-4),161.0 (C-5), 98.9 (C-6),161.0 (C-7), 94.3 (C-8),155.2 (C-9),104.3 (C-10), 121.5 (C-1'),130.0 (C-2'和C-6'), 115.7 (C-3'和C-5'), 160.2 (C-4'),99.0.0 (C-1''), 70.0(C-2''),70.2(C-3''),71.5(C-4''),70.1(C-5''),18.1(C-6'')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致，故鑒定化合物為山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷(圖1)。

化合物3，黃色粉末,HCl-Mg反應(yīng)陽(yáng)性,FeCl3反應(yīng)陽(yáng)性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ):δ 6.42(1H,d,J=2.0 Hz, H-6),6.78(1H,d,J=2.0 Hz, H-8),7.80(2H,d,J=8.5 Hz，H-2'和H-6')，6.85(2H, d,J=8.5 Hz，H-3'和H-5')，5.35(1H,br.s,H-1'')，3.10-3.83(4H,m,2''-5''),0.83(3H,d,J=5.7Hz, H-6'')，5.54(1H,br.s,H-1''')，3.10-3.83 (4H, m, 2'''-5'''), 1.15 (3H, d, J=5.7Hz, H-6'''); 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δ156.0 (C-2), 133.9 (C-3), 177.5 (C-4), 161.5 (C-5), 99.9 (C-6), 161.2 (C-7), 94.3 (C-8), 157.2 (C-9),105.3(C-10), 120.5 (C-1'), 130.5 (C-2'和C-6'), 115.9 (C-3'和C-5'), 161.2 (C-4'), 98.0 (C-1''), 70.2 (C-2''),70.5(C-3''), 71.6 (C-4''), 70.1 (C-5''), 17.1(C-6''),102.0.0(C-1''),70.1(C-2''),70.1(C-3''), 71.1 (C-4''), 70.0 (C-5''), 17.8 (C-6'')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致，故鑒定化合物為山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷(圖1)。

化合物4，黃色粉末, HCl-Mg反應(yīng)陽(yáng)性, FeCl3反應(yīng)陽(yáng)性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ): δ 6.15(1H,brs, H-6)，6.38(1H, brs,H-8),8.05(2H,d,J=8.5 Hz，H-2'和H-6')，6.92 (2H,d,J=8.5 Hz，H-3'和H-5');δ146.4 (C-2),135.9(C-3),175.8(C-4),160.6 (C-5)，98.7(C-6),165.6 (C-7),93.7(C-8),156.3(C-9),102.4(C-10),121.2(C-l'),129.3(C-2'，6'),115.5(C-3'，5'),159.3(C -4')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致，故鑒定化合物為山奈酚(圖1)。

化合物5，黃色粉末, HCl-Mg 反應(yīng)陽(yáng)性, FeCl3反應(yīng)陽(yáng)性。1H NMR (CDCl3, 500 MHZ): δ6.20 (1H, 2.0Hz, H-6)，6.50 (1H, 2.0Hz, H-8), 7.76 (1H, d, J=2.0 Hz，H-2')，6.70 (1H, dd, J=8.5, 2.0 Hz，H-6'), 6.92 (1H, d, J=8.5 Hz，H-5'); δ147.4 (C-2), 135.9 (C-3), 175.9 (C-4), 160.9 (C-5)，98.2 (C-6), 165.1 (C-7), 93.7 (C-8), 156.3 (C-9), 102.0 (C-10), 122.2 (C-l'),115.3(C-2'),148.5(C-3'),146.3(C-4'),117.9(C-5'),121.7(C-6'), 55.5 (-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致，故鑒定化合物為異鼠李素(圖1)。

圖1 化合物的結(jié)構(gòu)

4 生物活性測(cè)定

采用Fe2+半胱氨酸誘導(dǎo)的肝微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化模型進(jìn)行抗氧化活性篩選, 結(jié)果表明化合物1～5均有較強(qiáng)的抗氧化活性，IC50值分別為10.5,11.2,10.3,9.6,8.5 μM。

5 結(jié)論

從水飛薊莖葉中首次分離得到5個(gè)黃酮類(lèi)化合物，這5個(gè)化合物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性，IC50值 8.5～11.2。本文的究對(duì)進(jìn)一步明晰水飛薊抗氧化活性成分有重要意義。

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黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院自主課題，編號(hào)：ZHY-Z29。

陳效忠(1962～)男，河北平泉人，學(xué)士，副教授。

張艷(1982～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，講師。E-mail：tonyyan20081982@163.com。

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1008-0104(2015)04-0035-02

2015-03-02)