孟慶云，李 麗，邵 巍，聶 磊

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157000)

法舒地爾對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷中Nogo-A的影響①

孟慶云1，李 麗1，邵 巍2，聶 磊1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157000)

目的：探討法舒地爾對缺氧缺血性腦損傷大鼠Nogo-A表達(dá)的影響。方法： 將105只新生7日齡Wistar大鼠隨機(jī)分為6h、12h、24h、72h和7d時(shí)段的假手術(shù)組(Sham組，35只)、缺氧缺血性腦損傷模型組(HIBD組，35只)、法舒地爾治療組(35只)，分別腹腔注射生理鹽水和法舒地爾(10mg/kg)。HE染色鏡下觀察腦組織病理變化。免疫組化法檢測Nogo-A表達(dá)。結(jié)果：①肉眼觀察：Sham組兩側(cè)大腦半球?qū)ΨQ；HIBD組隨時(shí)間延長腦組織水腫加重，可見大腦半球壞死灶；法舒地爾治療組腦組織水腫減輕。②HE染色：Sham組腦組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常。HIBD組可見細(xì)胞腫脹，核固縮、裂解，炎性細(xì)胞增多；法舒地爾治療組神經(jīng)細(xì)胞水腫及核固縮數(shù)量減少。③免疫組化：Sham組Nogo-A可見少量表達(dá)；HIBD組Nogo-A陽性細(xì)胞12h開始升高，24h達(dá)峰值，隨后表達(dá)逐漸降低；法舒地爾治療組除6h時(shí)間點(diǎn)外，各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均低于HIBD組(P<0.01)；HIBD組和法舒地爾組陽性細(xì)胞數(shù)多于Sham組(P<0.01)。結(jié)論：法舒地爾通過抑制Nogo-A的激活，促進(jìn)了軸突再生和修復(fù)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，為臨床防治HIBD提供了實(shí)驗(yàn)性的理論基礎(chǔ)。

缺氧缺血性腦損傷；Nogo-A；法舒地爾；神經(jīng)再生

缺氧缺血性腦損傷(hypoxicia-ischemicbraindamage,HIBD)是常見的引起新生兒神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的疾病, 其原因是由于中樞神經(jīng)缺氧缺血損傷后難以再生修復(fù)所致，它嚴(yán)重的影響了新生兒的生命及健康安全。目前認(rèn)為引起神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的障礙的主要原因之一為生長抑制因子，缺氧缺血性腦損傷過程中，抑制因子直接或間接地激活細(xì)胞內(nèi)Rho激酶(Rhokinase，Rock)信號傳導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致肌動蛋白骨架的重組和軸突生長錐的塌陷，使得軸突再生過程被迫阻斷。Nogo-A(Nogo髓鞘相關(guān)蛋白)因?yàn)榫哂泻軓?qiáng)的軸突生長抑制作用而倍受關(guān)注[1]；Rock抑制劑應(yīng)用在動物實(shí)驗(yàn)中，可以促進(jìn)不同程度的軸突再生，可以修復(fù)受損傷的神經(jīng)細(xì)胞。而法舒地爾因?yàn)槠鋵ock具有較為明顯的抑制作用，并具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用而逐漸的引起人們的廣泛重視。本課題是利用新生大鼠的HIBD模型來探討法舒地爾對Nogo-A的影響及其對神經(jīng)再生的促進(jìn)作用，為今后臨床治療HIBD提供了一種嶄新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑:鹽酸法舒地爾注射液：天津紅日藥業(yè)股份有限公司；Nogo-A抗體、SABC(兔IgG)試劑盒：武漢博士得生物工程有限公司；混合氣體(氮?dú)?92%,氧氣：8%)：佳木斯市金鼎氧氣廠；DAB顯色劑、抗體稀釋液：北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 模型制備:參照Rice方法[2]制備新生大鼠的缺氧缺血性腦損傷模型：新生大鼠給予乙醚吸入麻醉后取仰臥位, 同時(shí)固定四肢, 取其頸部正中切口，結(jié)扎左側(cè)頸總動脈，縫合好切口后放回原來的飼養(yǎng)環(huán)境中讓其恢復(fù)2～4h，之后放入 2000mL的密閉容器內(nèi), 放置于在37℃的水浴中，持續(xù)維持容器內(nèi)的溫度為36℃ , 同時(shí)以 2～3L/min的速度持續(xù)輸入8%的氧氣和92%的氮?dú)饣旌蠚怏w共 2～ 4h。

1.1.3 分組:健康清潔級的Wistar大鼠(280±20)g(購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)合籠后所生的120只7日齡清潔級的大鼠體重(12.5±3)g，隨機(jī)分為3組：Sham組、HIBD模型組、法舒地爾治療組，每組各35只。Sham組只做了左側(cè)頸總動脈的分離、不結(jié)扎，直接縫合切口，不做缺氧處理；HIBD組造模后給予生理鹽水0.25mL/kg腹腔內(nèi)注射；治療組在HIBD后立即給予腹腔內(nèi)注射法舒地爾10mg/kg，每日一次。分別于6h、12h、24h、72h、7d不同的時(shí)間點(diǎn)給予斷頸、處死。

1.1.4 取材:各組實(shí)驗(yàn)大鼠在相應(yīng)的觀察時(shí)間點(diǎn)處死，用10%的水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，并開胸充分暴露心臟，經(jīng)左心室迅速插管至主動脈，注入生理鹽水100mL，同時(shí)在右心房處剪一切口，直到流出的液體澄清為止。再次注入4%的多聚甲醛、0.lmol/LPBS的(pH7.4)100mL，等到肝臟已經(jīng)明顯變白同時(shí)肺臟明顯水腫后斷其頭并取全腦，同時(shí)立即保存于4%的多聚甲醛、0.1mol/LPBS的(pH7.4)溶液中，固定72h以上。之后把固定的鼠腦從視交叉后2～6mm處做腦組織的冠狀切面，并取其腦組織脫水、石蠟包埋。行冠狀切片(20μm)連續(xù)切片,每20張選取1張作免疫組化，并取部分切片給予HE染色。

1.1.5 形態(tài)學(xué)檢測：鼠腦組織的常規(guī)石蠟切片、HE染色, 光鏡觀察其腦組織的形態(tài)。

1.1.6Nogo-A免疫組化染色： 腦組織，制備連續(xù)切片，按試劑盒操作，一抗為(Nogo-A)1：100稀釋。二抗是山羊抗兔IgG，DAB顯色， 胞漿染成棕褐色的或棕黃色的為Nogo-A陽性細(xì)胞。采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法，于每張切片隨即選取5個(gè)不重復(fù)視野，在400倍的物鏡下計(jì)數(shù)Nogo-A的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均值。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS.19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對各組的數(shù)據(jù)給予正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)比較各組數(shù)據(jù)均數(shù)，進(jìn)行單因素方差。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察新生大鼠的腦體形態(tài)

Sham組大腦未見任何改變，大腦半球左右對稱。HIBD組：6h時(shí)結(jié)扎側(cè)的腦組織呈現(xiàn)輕度水腫；至12～24h時(shí)水腫較明顯， 到72h-7d時(shí)結(jié)扎側(cè)的大腦半球可見壞死病灶，腦半球的形狀發(fā)生改變。而法舒地爾治療組的腦組織水腫較HIBD組減輕，并且未見到液化壞死病灶。

2.2 HE染色

Sham組：腦組織的各部位結(jié)構(gòu)清晰、腦細(xì)胞層次清楚、形態(tài)正常。HIBD模型組：缺氧缺血12～24h時(shí)細(xì)胞腫脹，淡染空亮，胞漿疏松，神經(jīng)元的排列紊亂、數(shù)目減少，于72h～7d時(shí)細(xì)胞核裂解、固縮，炎性細(xì)胞增加。法舒地爾治療組：各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞水腫、核固縮數(shù)量均少于模型組。見圖1。

圖1 光鏡觀察新生大鼠腦組織形態(tài)×100

2.3 Nogo-A免疫組化

Sham組Nogo-A陽性顆粒有少量分布于細(xì)胞胞漿中，呈現(xiàn)棕黃色；HIBD組各時(shí)段Nogo-A陽性細(xì)胞表達(dá)在造模的12h開始逐漸上升，到24h時(shí)達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，與Sham組的Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)對比，有顯著差異(P<0.01)；法舒地爾治療組的表達(dá)部位及其變化的規(guī)律與HIBD組相似，陽性細(xì)胞數(shù)分別在12h,2h,72h和7d的表達(dá)均低于HIBD組，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)段Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)比較

注：a與Sham組相比較，P<0.05；b與HIBD組相比較，P<0.05。

3 討論

HIBD是新生兒所患的較為嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可引起神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重后遺癥，其后遺癥的發(fā)生與腦神經(jīng)的再生障礙密切相關(guān)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷后的再生修復(fù)能力取決于神經(jīng)元自身的再生能力及在神經(jīng)元生存環(huán)境條件中各種外源性的生長促進(jìn)性因子和抑制性因子的共同影響。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種神經(jīng)軸突生長抑制因子：Nogo髓鞘相關(guān)蛋白(Nogo-A)，髓鞘相關(guān)糖蛋白，少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白。而Nogo是一個(gè)與中樞髓磷脂相結(jié)合的特異性的抑制因子, 在CNS中廣泛表達(dá)，參與多種CNS疾患的發(fā)病[3～5]，它是抑制中樞神經(jīng)軸突再生的重要因素之一。在HIBD發(fā)生后，中樞神經(jīng)細(xì)胞軸突的生長被抑制與激活Rock關(guān)系密切，Nogo-A通過神經(jīng)元細(xì)胞膜上的受體與NgR結(jié)合、激活后并將Rock激活，讓其活化，導(dǎo)致生長錐塌陷，軸突的再生被抑制。而損傷區(qū)內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞在多種不利因素的影響作用下變形、壞死、結(jié)構(gòu)被破壞、細(xì)胞出現(xiàn)崩解，從而失去了它原有功能。而損傷區(qū)外的鄰近神經(jīng)元開始合成及積存神經(jīng)絲蛋白(它是髓鞘軸突中含量最多的蛋白，對維持神經(jīng)元的形態(tài)和軸漿運(yùn)輸及損傷神經(jīng)的修復(fù)非常重要)，以適應(yīng)神經(jīng)再生需要，最終修復(fù)神經(jīng)元。

在實(shí)驗(yàn)中，以新生7日齡大鼠為對象建立的HIBD模型，我們通過觀察當(dāng)發(fā)生缺氧缺血性損傷時(shí)，Nogo-A表達(dá)評估軸突損傷和再生反映，結(jié)果是Sham組新生大鼠的Nogo-A陽性細(xì)胞在海馬區(qū)、大腦皮層的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中都有表達(dá)，由此表明了Nogo-A在正常的腦組織中是存在的，并且可能參與著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和生長的調(diào)控。HIBD組12h表達(dá)升高，24h達(dá)到峰值，隨后表達(dá)逐漸降低。推測在腦損傷急性期Nogo-A表達(dá)增加，抑制軸突的再生；當(dāng)Nogo-A的表達(dá)達(dá)到峰值時(shí)，此時(shí)對軸突再生的抑制達(dá)到最大；隨著Nogo-A表達(dá)的降低，抑制作用逐漸減少。 法舒地爾是一種新型的異喹啉磺胺衍生物，它有良好的水溶性，對Rock有較強(qiáng)的抑制作用，是目前臨床上唯一可用的Rock選擇性抑制劑，且在腦組織中含量較高[6,7]。法舒地爾能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，提高神經(jīng)功能，促進(jìn)軸突再生[8]。梁燕[9]臨床實(shí)踐表明法舒地爾對缺血性腦卒中，急性腦梗死，急性腦栓塞等疾病均有很好的治療效果[10～12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾可有效的抑制新生大鼠腦缺血再灌注后Nogo-A及Rock的激活，能拮抗Nogo-A的抑制作用，從而促進(jìn)軸突的再生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：法舒地爾治療組無論是在肉眼觀察新生大鼠的腦體形態(tài)、還是HE染色的檢查結(jié)果均顯示：應(yīng)用法舒地爾后新生大鼠的腦組織損傷程度均輕于HIBD組； 而Nogo-A陽性細(xì)胞數(shù)在12h,24h,72h,7d的表達(dá)均較HIBD組低；提示給予法舒地爾治療HIBD后可以抑制Nogo-A的表達(dá)。因此，在新生大鼠的缺氧缺血性腦損傷的實(shí)驗(yàn)中，法舒地爾可能通過抑制Rho/Rock通路和抑制Nogo-A的激活，而促進(jìn)了軸突再生和修復(fù)，這為臨床防治HIBD提供了實(shí)驗(yàn)性的理論基礎(chǔ)。

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黑龍江省衛(wèi)生廳立項(xiàng)項(xiàng)目，項(xiàng)目編號：2012-195。

孟慶云 (1967～)女，黑龍江林口人，學(xué)士，副主任醫(yī)師。

R722.1

A

1008-0104(2015)04-0010-02

2015-03-24)