劉士臣，申福國，楊建華，喬建民，季慶輝，崔宏宇，張富運(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯54003;齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院)

高壓氧對大鼠脊髓損傷的治療作用及機制

劉士臣1，申福國2，楊建華1，喬建民1，季慶輝1，崔宏宇1，張富運1
(1佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003;2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院)

摘要:目的觀察高壓氧(HBO)治療對大鼠脊髓損傷(SCI)的治療作用，并探討其可能機制。方法25只健康清潔級成年SD大鼠隨機分為SCI組10只、HBO組10只、對照組5只，SCI組、HBO組大鼠均制備SCI模型，HBO組制模成功后采用HBO治療;對照組采取同前方法咬開椎板，不損傷脊髓，后給予縫合。觀察兩組大鼠不同時點(制模成功后6 h及1、3、7、14、21d，分別計為T1、T2、T3、T4、T5、T6)BBB評分及脊髓組織中突觸素ⅠmRNA。結(jié)果與對照組比較，HBO組、SCI組各時點(T3、T4、T5、T6)BBB評分及脊髓組織突觸素ⅠmRNA表達(dá)升高(P均＜0.05);與SCI組比較，HBO組各時點(T3、T4、T5、T6)BBB評分及脊髓組織突觸素ⅠmRNA表達(dá)升高(P均＜0.05)。結(jié)論HBO可促進大鼠損傷脊髓的恢復(fù)，其機制可能與上調(diào)損傷脊髓組織內(nèi)突觸素ⅠmRNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞:脊髓損傷;高壓氧;突觸素Ⅰ

Therapeutic effect of hyperbaric oxygen on spinal cord injury in rats and itsmechanism

LIU Shi-chen1，SHEN Fu-guo，YANG Jian-hua，QIAO Jian-min，JI Qing-hui，CUI Hong-yu，ZHANG Fu-yun
(1 The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the therapeutic effect of hyperbaric oxygen(HBO)on the spinal cord injury(SCI)，and to explore its possiblemechanism.Methods Twenty-five healthy and clean SD adult rats were randomlydivided into the SCI group(n =10)，HBO group(n =10)and the control group(n =5).The SCImodel rats were prepared in the SCI and HBO groups，after the success ofmolding，the HBO group received HBO treatment; the vertebral plates of rats in the control group were opened and sutured withoutdamage to the spinal cord.BBB rating and synaptophysinⅠmRNA in the spinal cord tissues atdifferent time points(6 h aftermolding and 1，3，7，14 and 21d，which is counted as T1，T2，T3，T4，T5and T6)were observed in the two groups.Results Compared with the control group，the BBB rating and synaptophysinⅠmRNA expression was increased in the HBO group and SCI group at each time point(T3，T4，T5and T6)(all P＜0.05).Compared with the SCI group，the BBB rating and synaptophysinⅠmRNA expression was increased in the HBO group at each time point(T3，T4，T5and T6)(all P＜0.05).ConclusionHBO promoted the recovery of the injured spinal cord of rats，whichmay be related with the up-regulation of synaptophysinⅠmRNA expression in the injured spinal cord tissues.

Key words:spinal cord injury; hyperbaric oxygen; synaptophysin Ⅰ

脊髓損傷(SCI)是中樞系統(tǒng)最嚴(yán)重的損傷之一，因其致殘率高，給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)［1］。由于神經(jīng)元不可再生，損傷后很難恢復(fù)，至今臨床治療仍未取得突破性進展。臨床上，高壓氧(HBO)治療已在SCI患者中得到應(yīng)用，但其具體治療機制尚不明確［2］。突觸素Ⅰ是主要存在于突觸前膜上的一種膜蛋白，它在神經(jīng)元間遞質(zhì)釋放發(fā)揮了非常重要的作用，它的表達(dá)與突觸的再生、延伸與其功能的恢復(fù)有關(guān)［3，4］。2014年11月～2015年1月，我們觀察了HBO治療對SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，并

探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器主要試劑:mRNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒(大連寶生生物公司)，引物(上海鼎安生物科技有限公司);主要儀器:仿Allen's致傷裝置(自行設(shè)計加工)，PCR擴增儀(美國PE公司)，全自動凝膠成像處理系統(tǒng)(Applied Biosystems公司)，NGT50B型高壓氧艙(煙臺冰輪鍋爐有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國BioRad公司)，圖像分析儀(日本Olympus公司)。

1.2實驗動物及分組取健康清潔級成年SD大鼠25只，雌雄不限，體質(zhì)量(300±50)g，均由佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供和飼養(yǎng)，實驗過程中對動物的處理符合科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待動物的指導(dǎo)性意見》。所有實驗大鼠編號后按照隨機數(shù)字表分為SCI組10只、HBO組10只、對照組5只。

1.3急性SCI模型制備及HBO治療參照文獻(xiàn)［5］方法復(fù)制大鼠急性SCI模型。取SCI組和HBO組大鼠稱重，仰臥后以10%水合氯醛(0.3mL/100 g)腹腔注射麻醉，手術(shù)操作區(qū)除毛備皮、消毒、鋪巾，按照T9為中心上下做縱行正中切口約3 cm，依次切開分離使棘突完全顯露，去除棘突和椎板，完全暴露硬膜囊，取約3 cm2大小的墊片置于脊髓表面，用重10 g錘從10 cm高的瞄準(zhǔn)器上垂直打擊墊片，見脊髓組織出現(xiàn)腫脹、出血，大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮撲動后自然松弛，雙后肢遲緩性癱瘓，表明撞擊成功，急性SCI模型造模成功。HBO組大鼠在造模后帶籠放于動物高壓艙內(nèi)進行HBO治療，1 次/d，每次60min，共治療21d，具體方法按照參考文獻(xiàn)［6］進行。使用前用純氧洗艙20min，使艙內(nèi)氧氣體積分?jǐn)?shù)度超過95%，置入實驗大鼠后逐漸升壓至0.25mPa，歷時15min，穩(wěn)壓30min后逐漸減壓至標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，歷時15min。對照組采取同前方法咬開椎板后不損傷脊髓，后給予縫合。

1.4運動功能評價采用BBB運動功能評分方法［7］對實驗大鼠后肢各關(guān)節(jié)活動、步態(tài)和協(xié)調(diào)功能、爪的精細(xì)動作進行觀察評分。采用3人互盲獨立觀察評分，取3人平均值為實驗結(jié)果以減少誤差影響。

1.5脊髓組織突觸素Ⅰ檢測各組分別于制模成功后6 h及1、3、7、14、21d各處死2只(分別計為T1、T2、T3、T4、T5、T6)，打開胸腔暴露心臟，先后分別以生理鹽水和4%多聚甲醛溶液給予心內(nèi)持續(xù)灌注，直至流出液體清澈，灌注完成以T9為中心上下各1 cm切取脊髓組織，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別嚴(yán)格按照RNAiso Plus、RNA PCR試劑盒說明書提取總RNA;其次，取其濃度用紫外分光光度儀測量RNA含量;再次，按照RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，起始總RNA樣品均取2 μg嚴(yán)格按照反應(yīng)條件行RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件: 95℃變性5min，94℃、30 s，55℃、40 s，72℃、30 s，循環(huán)36周期，72℃延伸7min。取上述PCR產(chǎn)物進行電泳，以β-actin作為內(nèi)參照，結(jié)果以突觸素ⅠmRNA(OD 值)/β-actin(OD值)表示。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析及q檢驗(Newman-kueuls法)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠BBB評分比較結(jié)果見表1。

表1　各組大鼠BBB評分比較(分，)

表1　各組大鼠BBB評分比較(分，)

注:與對照組比較，aP＜0.05;與SCI組比較，bP＜0.05。

組別BBB 評分T1　T2　T3　T4　T5　T6 HBO組　0　0　4.42±0.01a　9.37±0.01ab　12.10±0.01ab　13.22±0.02aSCI組　0　0　3.23±0.02a　7.10±0.02a　9.07±0.02a　12.80±0.03a對照組　21.00±0.00　21.00±0.00　21.00±0.00　21.00±0.00　21.00±0.00　21.00±0.00

2.2各組大鼠脊髓組織突觸素ⅠmRNA表達(dá)比較結(jié)果見表2。

表2　各組大鼠脊髓組織突觸素ⅠmRNA表達(dá)比較()

表2　各組大鼠脊髓組織突觸素ⅠmRNA表達(dá)比較()

注:與對照組比較，aP＜0.05;與SCI組比較，bP＜0.05。

組別突觸素ⅠmRNA T1　T2　T3　T4　T5　T6 HBO組　0.06±0.01　0.05±0.02　0.45±0.01ab　1.67±0.02ab　1.61±0.03ab　1.21±0.04aSCI組　0.05±0.02　0.04±0.03　0.22±0.04a　1.06±0.01a　1.45±0.04a　1.03±0.03a對照組　0.04±0.01　0.04±0.01　0.04±0.01　0.04±0.01　0.04±0.01　0.04±0.01

3　討論

SCI后輕者會出現(xiàn)一定的神經(jīng)癥狀，重者會出現(xiàn)截癱、甚至死亡，由于神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)較差，所以SCI的保護及再生仍是困擾醫(yī)學(xué)工作者的難題

之一。雖然目前研究者對SCI的保護和治療機制有一定的認(rèn)知，但是對SCI后損傷神經(jīng)元保護或再生仍未有突破性進展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SCI后首先會出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞壞死或凋亡，刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致局部形成膠質(zhì)瘢痕，阻礙神經(jīng)元之間信號傳遞［8］。同時最近研究［2，9］發(fā)現(xiàn)，促紅細(xì)胞生成素對SCI有明顯的保護作用。

HBO治療疾病在臨床已經(jīng)運用近百年之久，早在1965年Maeda等人首先將HBO引入臨床嘗試性治療SCI患者，當(dāng)時取得了可喜的臨床療效，從此HBO引起了研究者的注意。研究初期學(xué)者們只是認(rèn)為HBO主要提高患者血氧飽和度，提高組織攝氧及氧彌散。當(dāng)今隨著對HBO研究進一步的深入，還發(fā)現(xiàn)HBO不僅可以提高血氧分壓和迅速改善組織的缺氧狀態(tài)，同時還可改善增強細(xì)胞線粒體酶活性，促進細(xì)胞對損傷修復(fù)和維持細(xì)胞正常代謝［10］，還可提高機體細(xì)胞及微環(huán)境中氧自由基含量［11］。有學(xué)者研究［12，13］發(fā)現(xiàn)，高壓氧可改善脊髓功能的恢復(fù)，但是目前對于HBO治療SCI損傷神經(jīng)元的保護作用機制仍在探尋中。

突觸結(jié)構(gòu)是神經(jīng)元之間信息傳遞、交換的重要結(jié)構(gòu)，其主要由突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜構(gòu)成。突觸素Ⅰ主要存在于突觸前膜上的一種膜蛋白，它在神經(jīng)元間遞質(zhì)釋放發(fā)揮了非常重要的作用，它的表達(dá)與突觸的再生、延伸與其功能的恢復(fù)有關(guān)［14］，被認(rèn)為是很好的突觸特異標(biāo)記物和功能指標(biāo)［15，16］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分化成熟神經(jīng)元細(xì)胞的軸突生長、延伸和軸突再塑性均受到機體的抑制，當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞受到損傷或周圍微環(huán)境發(fā)生改變時，損傷遠(yuǎn)端的突觸則會出現(xiàn)變性、萎縮、潰變，導(dǎo)致大量突觸功能喪失，從而使遠(yuǎn)端信號傳遞發(fā)生中斷，因此損傷遠(yuǎn)端突觸結(jié)構(gòu)的重建或重塑成為神經(jīng)功能恢復(fù)重要環(huán)節(jié)［17］，而突觸前膜中特異性相關(guān)蛋白突觸素Ⅰ的合成、分泌和運輸也成為突觸重建或再塑的至關(guān)重要的物質(zhì)之一。

本研究顯示，HBO組、SCI組各時點(T3、T4、T5、T6)BBB評分較對照組升高，HBO組各時點(T3、T4、T5、T6)BBB評分較SCI組升高，提示HBO可以保護或促進大鼠SCI神經(jīng)功能恢復(fù)。本研究還發(fā)現(xiàn)，HBO組、SCI組各時點(T3、T4、T5、T6)脊髓組織突觸素ⅠmRNA表達(dá)較對照組升高，HBO組各時點(T3、T4、T5、T6)脊髓組織突觸素ⅠmRNA表達(dá)較SCI組升高。提示BHO治療促進了大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，這可能是HBO改變了損傷脊髓組織中神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)或周圍微環(huán)境的作用，與上調(diào)神經(jīng)元內(nèi)突觸素ⅠmRNA表達(dá)有關(guān)。

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收稿日期:( 2015-04-27)

通信作者簡介:楊建華(1969-)，男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授，主要研究方向為關(guān)節(jié)骨科。E-mail: jianhua01@163.com

作者簡介:第一劉士臣(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向為脊柱外科和關(guān)節(jié)骨科。E-mail: liushichen1999@126.com

基金項目:黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(D201160);黑龍江省教育基金資助項目(12511539);佳木斯大學(xué)研究生創(chuàng)新科技項目(LZR2014-022)。

文章編號:1002-266X(2015)35-0016-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R363.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.35.005