周 軍，張 茉，王 杰

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

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藥品質(zhì)量與檢驗(yàn)

調(diào)經(jīng)益靈片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

周 軍，張 茉，王 杰

(天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

目的：提高調(diào)經(jīng)益靈片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)制劑中的當(dāng)歸、川芎、香附、青蒿進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法測(cè)定了α-香附酮的含量。結(jié)果：薄層色譜中的特征斑點(diǎn)明顯。α-香附酮在0.036 5～2.736 μg線性關(guān)系良好, 平均回收率為97.25 %, RSD為0.59 %(n=6)。結(jié)論：本法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、快速，可以作為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。

調(diào)經(jīng)益靈片，當(dāng)歸，川芎，香附，青蒿，白芍，牡丹皮，薄層色譜，α-香附酮，高效液相色譜法

調(diào)經(jīng)益靈片是由香附、當(dāng)歸、川芎、白芍、青蒿、牡丹皮等13味藥材制成的中藥片劑，具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血，開郁舒氣的功效，用于婦人血虛氣滯、腰酸腹痛、月經(jīng)不調(diào)、赤白帶下等各種婦科病。湖南德康制藥股份有限公司生產(chǎn)的樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(YBH05342004)，標(biāo)準(zhǔn)中包括顯微鑒別、薄層鑒別(當(dāng)歸、川芎、香附、青蒿、白芍)及白芍(芍藥苷)的HPLC含量測(cè)定；天津市力生制藥股份有限公司生產(chǎn)的樣品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十九冊(cè)》(WS3-B-3669-98)，標(biāo)準(zhǔn)中包括顯微鑒別、薄層鑒別(當(dāng)歸、川芎)。調(diào)經(jīng)益靈片法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，鑒別項(xiàng)提取方法較為煩瑣、重現(xiàn)性差，未對(duì)處方中的君藥(香附)進(jìn)行含量測(cè)定的缺點(diǎn)，不能有效控制藥品質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法對(duì)制劑中的當(dāng)歸(川芎)、香附、青蒿進(jìn)行了鑒別，并采用高效液相色譜法測(cè)定處方中的君藥香附中有效成分α-香附酮的含量，結(jié)果表明本法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、快速，使產(chǎn)品的質(zhì)量得到有效的控制，保證了臨床療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀，配有LC-20AD 泵、SIL-20自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-20A紫外檢測(cè)器、CTO-20AC柱溫箱；LC-solution 色譜工作站；AS20500ADT 超聲波清洗機(jī)(360 W，AUTO SCIENCE科技有限公司)；AG135 型電子天平(梅特勒-托利多公司)；硅膠G 薄層板(青島海洋化工廠)。

1.2 試藥 調(diào)經(jīng)益靈片樣品：湖南德康制藥股份有限公司(批號(hào)091001、090201、090601，薄膜衣片)，天津市力生制藥股份有限公司(批號(hào)0906001，糖衣片)。α-香附酮(批號(hào)110748-201111)、芍藥苷(批號(hào)110736-201136)、丹皮酚(批號(hào)110708-200506)、當(dāng)歸(批號(hào)120927-201014)、川芎(批號(hào)120918-201110)、青蒿(批號(hào)121016-201004)，均由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇為色譜純，乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、環(huán)己烷、甲苯、冰醋酸、三氯甲烷、甲酸、二硝基苯肼為分析純，水為去離子水。

2 鑒別

2.1 當(dāng)歸和川芎的薄層鑒別 取本品20 片，除去包衣，研細(xì)，加乙醇50 ml，超聲處理(功率350 W，頻率40 kHz)60 min，濾過，濾液低溫(40～60 ℃)蒸干，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次20 ml，合并乙醚液(水液備用)，低溫蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸、川芎對(duì)照藥材各1 g，分別加乙醚10 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液低溫蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再按處方配比，取處方藥材適量(當(dāng)歸、川芎除外)制成陰性樣品，按照供試品溶液的方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各6～10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖1。

2.2 香附薄層鑒別 取“2.1”項(xiàng)下的供試品溶液，作為供試品溶液。另取α-香附酮對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再按處方配比，取處方藥材適量(香附除外)制成陰性樣品，按照供試品項(xiàng)下的方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)[1]試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各6～10 μl及對(duì)照品溶液2～4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(92∶5∶5)為展開劑，取出，晾干，噴以二硝基苯肼試液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖2。

1.-陰性樣品 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2

1.陰性樣品 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2

2.3 青蒿薄層鑒別 取“2.1”項(xiàng)下乙醚提取后的水液，加乙酸乙酯提取2 次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液(水液備用)，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取青蒿對(duì)照藥材1 g，加甲醇10 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再按處方配比，取處方藥材適量(青蒿除外)制成陰性樣品，按照供試品項(xiàng)下的方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各6～10 μl，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶6∶7∶1.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇，在105 ℃加熱10 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖3。

1.陰性樣品 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2

2.4 白芍薄層鑒別 取“2.3”項(xiàng)下乙酸乙酯提取后的水液，加水飽和的正丁醇提取2 次，每次20 ml，合并正丁醇液，加氨試液洗滌2 次，每次20 ml，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再按處方配比，取處方藥材適量(白芍除外)制成陰性樣品，按照供試品項(xiàng)下的方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各6～10 μl，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾[2]。結(jié)果見圖4。

1.陰性樣品 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2 4.湖南樣品3 5.天津樣品 6.芍藥苷對(duì)照品

2.5 牡丹皮薄層鑒別 取本品適量，除去包衣，研細(xì)，取10 g，置圓底燒瓶中，加水100 ml，連接揮發(fā)油提取器，自測(cè)定器上端加水使充滿刻度，再加入石油醚(60～90 ℃)1 ml，緩緩加熱至沸，并保持微沸1 h，放冷，取石油醚液作為供試品溶液。另取丹皮酚對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再按處方配比，取處方藥材適量(牡丹皮除外)制成陰性樣品，按照供試品項(xiàng)下的方法提取，作為陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各6～10 μl，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(4∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖5。

1.陰性溶液 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2 4.湖南樣品3 5.天津樣品 6.丹皮酚對(duì)照品

3 香附的HPLC法測(cè)定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 資生堂 SPOLAR-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水(75∶25)；柱溫：40 ℃；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長：250 nm。理論板數(shù)按α-香附酮峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000[3-5]。

3.2 溶液制備

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取α-香附酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml中含α-香附酮28 μg的溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備 取同一批號(hào)(091001)樣品適量，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，精密加入80%甲醇25 ml，稱定重量，超聲提取60 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣，測(cè)定，即得。

3.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方取除香附的各味藥材，按【制法】制得樣品，再按“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。分別精密吸取對(duì)照品、供試品和陽性樣品溶液10 μl，依“3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，陰性樣品無干擾，見圖1。

1.α-香附酮

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取α-香附酮對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成濃度為每1 ml中含α-香附酮3.648、7.296、18.24、36.48、91.20和273.60 μg的對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y=-2 024.26+1 816 990.05X(r=0.999 9)。結(jié)果表明α-香附酮在0.036 5～2.736 μg范圍內(nèi)線性良好。

3.4 精密度試驗(yàn) 取同一批(批號(hào)091001)適量，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，精密加入80%甲醇25 ml，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定α-香附酮峰面積，RSD為0.36%，符合要求。

3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批(批號(hào)091001)樣品適量，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入80%甲醇25 ml，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定，樣品中α-香附酮的含量為1.359 6 mg/g，RSD為0.11%，符合要求。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批(批號(hào)091001)樣品適量，研細(xì)，取0.5 g，精密稱定，精密加入80%甲醇25 ml，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、16和24 h進(jìn)樣測(cè)定，RSD為1.61%，符合要求。

3.7 回收率試驗(yàn) 取同一批(批號(hào)091001)樣品適量，研細(xì)，取0.25 g，精密稱定，共6 份，分別精密加入每1 ml中含α-香附酮0.014 59 mg/ml的80%甲醇對(duì)照品溶液25 ml，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供回收率用供試品溶液，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析。計(jì)算回收率，結(jié)果α-香附酮平均回收率為97.25%，RSD為0.59%，結(jié)果見表1。

表1 α-香附酮回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.8 樣品測(cè)定 取兩個(gè)廠家4個(gè)不同批號(hào)的樣品，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，按“3.1”項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定，計(jì)算樣品中α-香附酮的含量，見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 在TLC鑒別試驗(yàn)中根據(jù)被測(cè)定藥材中相應(yīng)成分的性質(zhì)對(duì)提取方法進(jìn)行科學(xué)合理的安排：①采用乙醇提取出主要成分后，先用乙醚提取低極性的成分(當(dāng)歸、川芎、香附)，再用乙酸乙酯提取極性相對(duì)較大的成分(青蒿)，最后用正丁醇提取極性更大的成分(白芍)；②牡丹皮的處方量較小，并且直接用乙醚提取部分作為供試品溶液，展開后樣品中存在其他雜質(zhì)嚴(yán)重干擾的情況；根據(jù)丹皮酚具有揮發(fā)性的特點(diǎn)，采用提取揮發(fā)油的方式進(jìn)行提取，結(jié)果滿意。本文建立的薄層鑒別方法具有簡便、雜質(zhì)干擾小、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。

4.2 在本實(shí)驗(yàn)中建立的TLC鑒別方法，在不同品牌(青島、煙臺(tái)、默克)薄層板、室溫條件、低溫(≤10 ℃)、高濕(≥75 %)等影響因素下進(jìn)行了耐用性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，上述因素對(duì)薄層鑒別效果均無顯著影響，表明本實(shí)驗(yàn)建立的TLC方法可靠、穩(wěn)定。

4.3 HPLC分析中分別采用甲醇-水(70∶30)、甲醇-水(75∶25)與乙腈-水(70∶30)為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)[1-4]。結(jié)果，采用甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相，供試品色譜中α-香附酮色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離較好，且峰形對(duì)稱，故采用甲醇-水(75∶25)為流動(dòng)相。

4.4 考查采用甲醇、90%甲醇、80%甲醇三種不同的提取溶劑[5-7]，分別采用加熱回流提取及超聲提取，最后確定以80%甲醇為溶劑超聲處理提取較完全；經(jīng)考查不同的提取時(shí)間，結(jié)果超聲提取60 min樣品中α-香附酮的量最高。

4.5 經(jīng)測(cè)定兩個(gè)廠家的4批樣品，α-香附酮測(cè)定結(jié)果分別為0.417 9、0.032 3、0.173 5和0.312 0 mg/片，由測(cè)定值可以看出不同廠家和批號(hào)樣品中α-香附酮的量相差極大，因此增加α-香附酮的測(cè)定對(duì)控制調(diào)經(jīng)益靈片藥品的質(zhì)量有重要的意義。

4.6 文獻(xiàn)報(bào)道[8]，測(cè)定調(diào)經(jīng)益靈片中α-香附酮的方法是采用揮發(fā)油提取器提取后再進(jìn)行測(cè)定，提取方法煩瑣、費(fèi)時(shí)，本文采用的方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、快速，使產(chǎn)品的質(zhì)量得到有效的控制，保證了臨床療效。

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2014-10-23

R927.11

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1006-5687(2015)02-0010-04