黃爍丹,張惠琴,鄒　婕,莊宇嫦,熊　蓉,吳　維,徐　怡,肖硯微,鄒秀齊

(1.梅州市婦幼保健院，廣東 梅州514021；2.梅州市人民醫(yī)院，廣東 梅州514021)

新生兒干血斑β地中海貧血篩查方法的研究

黃爍丹1,張惠琴2,鄒婕1,莊宇嫦1,熊蓉1,吳維1,徐怡1,肖硯微1,鄒秀齊1

(1.梅州市婦幼保健院，廣東 梅州514021；2.梅州市人民醫(yī)院，廣東 梅州514021)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0582)

地中海貧血(簡(jiǎn)稱“地貧”)又稱珠蛋白生成障礙性貧血，是我國(guó)華南地區(qū)高發(fā)的遺傳性溶血性疾病，亦是南方地區(qū)重點(diǎn)防治的單基因遺傳病[1-3]，由β珠蛋白基因異常導(dǎo)致β珠蛋白肽鏈合成缺乏稱為β地貧。采取現(xiàn)代化先進(jìn)技術(shù)，通過(guò)有效模式對(duì)新生兒進(jìn)行β地貧早期篩查和干預(yù)，意義重大。目前，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)大規(guī)模新生兒β地貧篩查的報(bào)道，缺乏較成熟的篩查方法和工作模式，本研究應(yīng)用新生兒疾病篩查的濾紙干血斑標(biāo)本，采用全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳技術(shù)，建立了一套用于新生兒β地貧篩查的綜合分析法，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1樣本與方法

1.1　樣本

1.1.1樣本采集 2012年1月至2013年12月，按照新生兒疾病篩查標(biāo)本采集技術(shù)規(guī)范，對(duì)145904例在梅州市各醫(yī)療保健機(jī)構(gòu)出生的新生兒，于出生后3-7天，在知情同意的情況下采集足跟血血斑標(biāo)本，遞送至本機(jī)構(gòu)進(jìn)行電泳篩查，并對(duì)篩查陽(yáng)性者召回進(jìn)行基因診斷。

1.1.2標(biāo)本分組從2012年1月至2013年3月采集的95059例標(biāo)本用“HbA界值法” 篩查β地貧；從2013年4月-12月采集的50845例標(biāo)本用 “綜合分析法”篩查β地貧；2013年4月采集的標(biāo)本中隨機(jī)抽取600例標(biāo)本同時(shí)用 “HbA界值法”和“綜合分析法”篩查β地貧，血斑標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行地貧基因檢測(cè)。

1.2　儀器與試劑

1.2.1血紅蛋白分析采用法國(guó)Sebia公司的Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及配套血紅蛋白電泳試劑盒。

1.2.2基因檢測(cè)基因擴(kuò)增儀、分子雜交儀及β地貧基因診斷試劑盒 (廣東凱普生物技術(shù)有限公司提供)。

1.3　新生兒干血斑血紅蛋白電泳

1.3.1血紅蛋白電泳從濾紙干血斑打下一個(gè)4.84 mm2血斑片，置于50 μL 蒸餾水的測(cè)試杯中溶解，保濕過(guò)夜，第二天將準(zhǔn)備好的測(cè)試杯直接放入Sebia Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀中檢測(cè)，按照儀器的操作規(guī)程完成標(biāo)本檢測(cè)。

1.3.2根據(jù)Sebia Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀報(bào)告的結(jié)果分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)標(biāo)本的HbA、HbA2的含量。

1.4　β地貧篩查陽(yáng)性的判讀

1.4.1HbA界值法根據(jù)血紅蛋白組分HbA的含量判斷β地貧篩查陽(yáng)性，電泳結(jié)果如HbA≤9.5%(切值為廠家提供)或出現(xiàn)HbE則判斷為β地貧篩查陽(yáng)性，如HbA < 2.5%，則疑為重型β地貧。

1.4.2綜合分析法根據(jù)血紅蛋白組分HbA含量、HbA2含量及HbA2/HbA比值篩查β地貧陽(yáng)性，具體方案如表1所示。

表1　綜合分析法β地貧篩查陽(yáng)性判斷表

*注：篩查時(shí)若出現(xiàn)HbE，直接判斷為篩查陽(yáng)性。

1.5　基因檢測(cè)

采用聚合酶鏈反應(yīng)-反向點(diǎn)雜交(PCR-RDB)技術(shù)進(jìn)行南方地區(qū)常見(jiàn)的16種β珠蛋白基因點(diǎn)突變分析，檢測(cè)的突變位點(diǎn)包括41-42、IVS-II-654、-28、71-72、17、βE、31、IVS1-1、27/28、43、-29、-30、14-15、CAP、Int和IVS1-5。

1.6　統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用MedCalc 12.3.0軟件包進(jìn)行處理。以基因診斷結(jié)果為β地貧診斷標(biāo)準(zhǔn)，分別統(tǒng)計(jì)分析HbA界值法和綜合分析法的診斷敏感度、特異度、準(zhǔn)確性及假陽(yáng)性率，卡方檢驗(yàn)(χ2)比較兩者的診斷價(jià)值，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1新生兒干血斑血紅蛋白毛細(xì)管電泳結(jié)果

如圖1所示，新生兒干血斑毛細(xì)管電泳可精確分離并檢測(cè)Hb Bart’s、HbA、HbF和HbA2等血紅蛋白組分。用配套軟件將HbA2區(qū)放大后進(jìn)行判讀，可靈敏檢測(cè)到含量<0.1%的HbA2。

2.2篩查結(jié)果陽(yáng)性的血紅蛋白電泳圖譜圖2和圖3分別顯示利用HbA界值法和綜合分析法篩查結(jié)果為陽(yáng)性的血紅蛋白電泳圖，圖示中的標(biāo)本均經(jīng)過(guò)基因檢測(cè)確診為β地貧。

2.3HbA界值法篩查陽(yáng)性的基因確診符合率

采用HbA界值法篩查的95059例標(biāo)本中陽(yáng)性3941例，篩查陽(yáng)性率4.1%，召回篩查陽(yáng)性者1580例進(jìn)行了地貧基因檢測(cè)，確診為β地貧716例，符合率45.32%，假陽(yáng)性率54.68%。其中召回的13例HbE全部確診為輕型β地貧(βE雜合子)，符合率為100%；召回的37例篩查疑為中重型β地貧者有35例確診為β地貧純合子或雙重雜合子(2例為雜合子)，中重型β地貧符合率為94.6%，β地貧符合率為100%。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1毛細(xì)管電泳可準(zhǔn)確的檢測(cè)新生兒干血斑標(biāo)本中的

Hb Bart`s、HbA 、HbF、HbA2

圖2　HbA界值法篩查陽(yáng)性圖　 A、B為兩個(gè)不同的陽(yáng)性篩查結(jié)果，A疑為重型β地貧。

圖3　綜合分析法篩查陽(yáng)性圖

表2　HbA界值法篩查陽(yáng)性召回基因確診結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.4綜合分析法篩查陽(yáng)性的基因確診符合率

采用綜合分析法篩查的50845例標(biāo)本中陽(yáng)性2032例，篩查陽(yáng)性率4.0%，召回篩查陽(yáng)性者1266例進(jìn)行基因檢測(cè)，確診為β地貧930例，符合率73.46%，假陽(yáng)性率26.54%。15例篩查疑為中重型β地貧者有14例確診為β地貧純合子或雙重雜合子(1例為輕型)，中重型β地貧符合率93.3%，β地貧為100%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　綜合分析法篩查陽(yáng)性召回基因確診結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.5HbA界值法和綜合分析法的對(duì)比研究

從2.3和2.4的結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)兩種方法的篩查陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，但綜合分析法篩查陽(yáng)性與基因檢測(cè)結(jié)果的符合率明顯高于HbA界值法，但由于上述的結(jié)論是針對(duì)不同的標(biāo)本，因此我們采用HbA界值法和綜合分析法分別對(duì)600例標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行篩查和基因檢測(cè)，其中β地貧22例，陰性578例，HbA界值法與綜合分析法的篩查結(jié)果如表4所示。表5顯示了兩種方法的篩查能力比較。結(jié)果表明，綜合分析法敏感度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和篩查的準(zhǔn)確性顯著高于HbA界值法(P均<0.05)，綜合分析法的的特異性和陰性預(yù)測(cè)值略高于HbA界值法(0.01>P>0.05)。

表4　HbA界值法與綜合分析法對(duì)600例標(biāo)本的篩查結(jié)果

表5　HbA界值法與綜合分析法診斷能力比較

3討論

正常新生兒的HbF約占70%，HbA 約占30%，HbA2少于1%[4]。地貧患兒的各種Hb組分和含量會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)分離技術(shù)分析各種血紅蛋白的成分和含量，從而判斷是否為地貧。新生兒干血斑標(biāo)本被廣泛應(yīng)用于多項(xiàng)新生兒出生疾病的篩查，不僅取血方便，且標(biāo)本易于運(yùn)輸，非常適用于新生兒疾病的常規(guī)篩查。目前新生兒地貧篩查多采用臍帶血，標(biāo)本不易保存和運(yùn)輸，限制了新生兒地貧篩查的廣泛應(yīng)用。用于分析新生兒干血斑標(biāo)本的全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳分析技術(shù)[5]的出現(xiàn)為解決這一難題提供了可能。全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳分析技術(shù)，利用新生兒濾紙干血斑中的微量血紅蛋白，在高壓電的作用下，在直徑為25微米的毛細(xì)管中實(shí)現(xiàn)不同血紅蛋白組分的分離。該技術(shù)對(duì)各種血紅蛋白組分檢測(cè)敏感、穩(wěn)定，可準(zhǔn)確地檢測(cè)并定量各種血紅蛋白組分，如Hb Bart’s、HbA、Hb F和HbA2等[5-8]，是目前新生兒地貧篩查最簡(jiǎn)便、有效的技術(shù)平臺(tái)[9]。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)此項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行β地貧篩查的研究報(bào)道。

正常胎兒從3個(gè)月開始合成HbA，至6個(gè)月時(shí)增加到5%-10%，分娩時(shí)可達(dá)到35%-40%。β地貧患兒由于β珠蛋白合身障礙，其HbA含量低于正常新生兒，且HbA水平越低提示β地貧越嚴(yán)重，因此，臨床常利用HbA含量篩查β地貧[10]。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外新生兒地貧篩查研究[8-12]，結(jié)合作者實(shí)驗(yàn)室的臨床經(jīng)驗(yàn)和廠家提供的切值，把HbA<9.5%作為HbA界值法篩查β地貧的初步方案，篩查的陽(yáng)性率為4.1%，略高于黃爍丹報(bào)導(dǎo)的分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果3.4%[13]。其中，把HbA<2.5%作為重型β地貧的篩查閾值，研究發(fā)現(xiàn)，其篩查的重型β地貧新生兒基因確診符合率是98.1%，證明HbA<2.5%是新生兒重型β地貧的有效篩查指標(biāo)。對(duì)HbA界值法篩查出的全部陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行基因確診試驗(yàn)表明，確診符合率為45.32%，假陽(yáng)性率54.68%。此結(jié)果明顯低于陳和平[11]、甘冰[12]等利用瓊脂糖電泳檢測(cè)臍帶血HbA含量篩查β地貧的確診符合率(分別為84.3%和78.4%)。這可能與本研究采用的是新生兒干血斑毛細(xì)管電泳法，而他們用的是臍帶血瓊脂糖電泳法有關(guān)，另一方面，干血斑標(biāo)本是在出生后3-7天采集，臍血是出生時(shí)即采，標(biāo)本采集時(shí)機(jī)不同可能也有關(guān)系。HbA界值法由于假陽(yáng)性率偏高，造成過(guò)多的不必要召回和復(fù)診，給受檢者造成不必要的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)，分析方法急需改良。

研究中我們發(fā)現(xiàn)，HbA界值法篩查陽(yáng)性標(biāo)本的HbA含量主要分布在7.4%-9.5%區(qū)間，占總篩查陽(yáng)性數(shù)的67.12%，但其確診符合率僅為34.18%，假陽(yáng)性率高達(dá)65.82%。可見(jiàn)，該區(qū)間是造成HbA界值法篩查假陽(yáng)性率高的主要原因，本研究針對(duì)這一部分進(jìn)行了改良，建立了綜合分析法。

綜合分析法是在HbA界值法的基礎(chǔ)上，結(jié)合HbA2的含量、HbA2/HbA比值和HbE建立起來(lái)用于新生兒β地貧篩查的毛細(xì)管血紅蛋白電泳結(jié)果分析方法。由于δ珠蛋白的合成開始于妊娠后期，新生兒血液中可出現(xiàn)微量的Hb A2(α2δ2)[8]，β地貧新生兒出現(xiàn)代償性的δ肽鏈合成增加或提前出現(xiàn)，使HbA2比例升高或者提前出現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)采用的全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳分析技術(shù)檢測(cè)新生兒干血斑標(biāo)本，可敏感檢測(cè)出微量HbA2，為綜合分析法的建立提供了條件。研究中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HbA<7.4%時(shí)，HbA2與β地貧無(wú)相關(guān)性，故綜合分析法未把HbA2/HbA比值做為判斷指標(biāo)，此部分陽(yáng)性者的確診符合率與HbA界值法接近(63.27% vers 64.67%)；而針對(duì)HbA在7.4%-9.5%區(qū)間的陽(yáng)性者，綜合分析法引入HbA2/HbA比值作為篩查指標(biāo)之一，確診符合率明顯提高(66.41% verse 34.18%)，顯著降低了此區(qū)間的假陽(yáng)性率。針對(duì)HbA界值法無(wú)法篩查的HbA >9.5%的新生兒標(biāo)本，綜合分析法創(chuàng)新性的結(jié)合HbA2/HbA比值，其篩查出的陽(yáng)性標(biāo)本確診符合率高達(dá)82.1%，這部分屬于HbA界值法無(wú)法篩查到的漏篩病例。經(jīng)上述初步試驗(yàn)結(jié)果表明，綜合分析法總的確診符合率提高到73.46%，假陽(yáng)性率降低至26.54%，明顯優(yōu)于HbA界值法。

鑒于綜合分析法的初步評(píng)估試驗(yàn)與HbA界值法的評(píng)估試驗(yàn)來(lái)源于不同的標(biāo)本，為進(jìn)一步明確兩種血紅蛋白電泳分析方法篩查β地貧的優(yōu)劣，我們利用HbA界值法和綜合分析法分別對(duì)600例樣本同時(shí)進(jìn)行篩查，并全部進(jìn)行基因檢測(cè)。結(jié)果表明，綜合分析法的敏感度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和篩查準(zhǔn)確性顯著高于HbA界值法(P均<0.05)，特異性和陰性預(yù)測(cè)值也是綜合分析法高于HbA界值法。

綜上所述，新生兒干血斑的全自動(dòng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳技術(shù)簡(jiǎn)便、易用，包括HbA、HbA2和HbA2/HbA比值的綜合分析法可顯著提高篩查β地貧的敏感度和準(zhǔn)確性。綜合分析法值得通過(guò)目前已較完善的新生兒疾病篩查網(wǎng)絡(luò)大力推廣，以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的地貧篩查和防控。

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摘要：目的探討全自動(dòng)毛細(xì)管微量血紅蛋白電泳技術(shù)在新生兒β地中海貧血篩查中的應(yīng)用價(jià)值，并尋求有效的篩查方法。方法使用Sebia全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀對(duì)145904例新生兒濾紙干血斑標(biāo)本進(jìn)行血紅蛋白(Hb)電泳；對(duì)95059例標(biāo)本的電泳分析結(jié)果以HbA界值法判讀β地貧篩查結(jié)果，對(duì)50845例標(biāo)本的電泳分析結(jié)果以HbA值結(jié)合HbA2/HbA比值的綜合分析法判讀β地貧篩查結(jié)果，召回篩查陽(yáng)性者進(jìn)行地貧基因診斷；隨機(jī)對(duì)600份標(biāo)本的電泳結(jié)果同時(shí)以上述兩種方法判讀β地貧篩查結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行基因檢測(cè)作為β地貧診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)比較兩種判讀方法的差異。結(jié)果HbA界值法篩查出的1580例陽(yáng)性標(biāo)本中經(jīng)基因檢測(cè)確診為β地貧的有716例，確診符合率45.32%，假陽(yáng)性率為54.68%；綜合分析法篩查出的1266例陽(yáng)性標(biāo)本中930例經(jīng)基因檢測(cè)確診為β地貧，符合率73.46%，假陽(yáng)性率為26.54%。同時(shí)對(duì)600例新生兒干血斑分析結(jié)果表明，HbA界值法和綜合分析法的敏感度和特異度分別是54.55%、90.91%和97.58%、99.31%，兩者的篩查準(zhǔn)確性分別為96%和99%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，綜合分析法的敏感度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和篩查的準(zhǔn)確性顯著高于HbA界值法.結(jié)論新生兒干血斑標(biāo)本經(jīng)毛細(xì)管血紅蛋白電泳后，利用包含HbA、HbA2組分的含量及HbA2/HbA比值的綜合分析法判讀電泳結(jié)果，篩查新生兒β地貧，靈敏度和準(zhǔn)確性顯著提高，假陽(yáng)性率明顯降低，值得推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：β地中海貧血；毛細(xì)管電泳；新生兒；干血斑

The study of beta-thalassemia screening methods of Neonate dry blood spot samplesHUANGShuo-dan,ZHANGHui-qin,ZHOUJie,etal.(1.MaternalandChildHealthHospitalinMeizhou,Meizhou514021China)

Abstract:ObjectiveEvaluate the application of capillary hemoglobin electrophoresis in neonate beta-thalassemia screening.MethodsThe Hb electrophoresis of 145904 dry neonatal blood samples was analyzed on Sebia Capillary Neonate Fast.The HbA cut-off value (Method I) was used to screen beta-thalassemia for 95059 dry blood samples and the combination of HbA value and HbA2/HbA ratio (Method II) was used to screen beta-thalassemia for the remaining 50845 dry blood samples.The subjects with positive results were recalled and confirmed by genotyping test.The 600 dry blood samples were collected randomly and the Hb electrophoresis results were check by both of Method I and Method II.The genotyping test was the reference to analyze the difference of both of the methods.ResultsThe genetic diagnosis results of recalled 1580 positive cases according to the Method I showed that the true positive were 716 cases with true positive rate 45.32% and false positive rete 54.68%.The 930 cases were verified by genetic diagnosis among the recalled 1266 cases according to the Method II with true positive rate 73.46% and false positive rete 26.54%.The results of 600 samples showed that the sensitivity and specificity for beta-thalassemia screening of Method I and Method II were 54.55%、90.91%和97.58%、99.31% respectively.The true positive rates were 96% and 99% for Method I and Method II respectively.The results demonstrated that the Method II is superior to Method I for beta-thalassemia screening.ConclusionAfter the capillary dry blood Hb electrophoresis analysis,the combination of HbA value and HbA2/HbA ratio method for beta- beta-thalassemia screening is more sensitive and specific and lower false positive rate than HbA cut-off value method and the combination of HbA value and HbA2/HbA ratio method should be applied to more areas for newborn screening.

Key words:beta-thalassemia; capillary electrophoresis; neonate; dry blood spot

收稿日期：(2014-06-20)

作者簡(jiǎn)介：黃爍丹，男，38歲，副主任技師，遺傳中心主任，醫(yī)務(wù)科副科長(zhǎng),研究方向是新生兒遺傳代謝病篩查和早期干預(yù)技術(shù)。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R556.6+1

文章編號(hào)：1007-4287(2015)04-0582-05

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)基金立項(xiàng)課題(A2012762)