麻藝聰， 周 鑫,2， 繆園園,2， 徐 勇， 勇 強,2， 余世袁,2

(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院, 江蘇 南京 210037； 2.江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點實驗室, 江蘇 南京 210037)

·研究報告——生物質(zhì)化學(xué)品·

Glucobacteroxydans全細胞直接催化秸稈稀酸預(yù)處理水解液產(chǎn)木糖酸

麻藝聰1， 周 鑫1,2， 繆園園1,2， 徐 勇， 勇 強1,2， 余世袁1,2

(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院, 江蘇 南京 210037； 2.江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點實驗室, 江蘇 南京 210037)

以長期馴化選育得到的耐抑制物氧化葡萄糖酸桿菌GlucobacteroxydansNL71為催化菌株，對全細胞直接催化木質(zhì)纖維(麥稈)稀酸預(yù)處理水解液產(chǎn)木糖酸的工藝進行研究。結(jié)果表明：未脫毒水解液對催化反應(yīng)生產(chǎn)木糖酸具有抑制作用，且隨濃度提高，抑制作用增強。提高細胞濃度和提高供氧能力可以有效抵抗麥桿稀水解液的抑制效應(yīng)。在搖瓶體系中以2 g/L細胞接種量直接催化未經(jīng)脫毒的麥稈稀酸水解濃縮液，當初始木糖質(zhì)量濃度超過100 g/L時，細胞的催化性能受到嚴重抑制，木糖酸得率均低于50%；當細胞接種量提升至8 g/L時，木糖酸得率可以達到85.7%；在機械攪拌式通氧加壓反應(yīng)體系中，采用密封加氧技術(shù)對100 g/L木糖濃度的麥秸稀酸水解濃縮液全細胞催化24 h的細胞接種量8 g/L，木糖酸終質(zhì)量濃度達到103.1 g/L，木糖酸得率可達到93.1%，產(chǎn)生速率為搖瓶體系的1.6倍。

木糖酸；木糖；全細胞催化；氧化葡萄糖酸桿菌；麥稈水解液

植物纖維素資源中可利用的糖類主要是纖維素和半纖維素，其中以纖維素為原料的葡萄糖發(fā)酵工業(yè)相對成熟。然而，植物纖維中以木糖為主的半纖維素約占20%～35%，其高效轉(zhuǎn)化與利用則成為整個生物煉制系統(tǒng)的關(guān)鍵性技術(shù)瓶頸之一[1-5]。近年來，木糖酸作為植物纖維資源木糖高效生物轉(zhuǎn)化利用的新興產(chǎn)品具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用潛力[6-9]，被美國能源部確定為植物纖維資源生物質(zhì)煉制最具發(fā)展前途的30種目標產(chǎn)品或化工基本構(gòu)件單元之一。Zhou等[10]利用長期馴化選育的菌株葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans) NL71優(yōu)良的生產(chǎn)性能，在富含D-木糖經(jīng)CaCO3或Ca(OH)2中和吸附脫毒后的玉米秸稈稀酸預(yù)處理濃縮液中，直接采用全細胞催化轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖酸,產(chǎn)量可達到143.9 g/L。Buchert等[11]研究表明G.oxydans可催化經(jīng)脫毒后玉米秸稈稀酸水解液中100 g/L木糖轉(zhuǎn)化為88 g/L木糖酸。Zhou等[10]對G.oxydans在搖瓶體系單一木糖催化生產(chǎn)木糖酸,得率可達98%以上，因此認為利用氧化葡萄糖桿菌直接以半纖維素水解液為底物催化生產(chǎn)木糖酸具有較好前景。本研究以小麥秸稈稀酸預(yù)處理水解濃縮液為原料，以NaOH替代CaCO3作為中和劑保留所有的抑制物陰離子，對G.oxydansNL71全細胞直接催化制取木糖酸的生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，期望為麥稈木糖的高效生物轉(zhuǎn)化與利用提供借鑒和指導(dǎo)。

1 實 驗

1.1 原料、試劑及儀器

小麥稈，來自江蘇連云港。NaOH、山梨醇、硫酸、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和硫酸銨,均為分析純；酵母粉為生化級。

Agilent 1260液相色譜，美國安捷倫公司；ICS-5000離子色譜，美國賽默公司；Ledend Mach 1.6R型離心機，美國賽默公司；Spectrumlab 752s紫外可見分光光度計；BioFlo?/CelliGen?115發(fā)酵罐，美國新布朗什維克科學(xué)公司；FB6410火焰光度計，上海精科有限公司。

1.2 菌種及培養(yǎng)基

氧化葡萄糖酸桿菌(G.oxydans)NL71，經(jīng)南京林業(yè)大學(xué)在木質(zhì)纖維水解液長期馴化選育后保藏。

活化培養(yǎng)基(g/L)：山梨醇50,酵母粉5。搖瓶及發(fā)酵罐水解液培養(yǎng)基(g/L)：MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，K2HPO4·3H2O 2，(NH4)2SO45，酵母粉5[5]。

1.3 麥稈水解液全細胞催化

1.3.1 麥稈稀酸預(yù)處理水解液制備 稱取一定質(zhì)量的麥稈(直徑1～3 cm)按固液比為1 ∶10(g ∶mL)加入質(zhì)量分數(shù)為1.0%的硫酸浸泡過夜，置于蒸煮反應(yīng)器中，在150 ℃的條件下反應(yīng)30 min[9]，取出物料后經(jīng)磨漿、過濾得濾液即為麥稈稀酸預(yù)處理水解液。

1.3.2 不同初始濃度麥稈水解液的全細胞催化 麥稈稀酸預(yù)處理水解液經(jīng)減壓真空濃縮至木糖質(zhì)量濃度分別為60.2、 73.6、 89.2、 100.9、 121.7、 139.7、 164.5和179.3 g/L，并以30% 的NaOH溶液調(diào)至pH值6.0。在250 mL三角搖瓶中加入50 mL水解液并按2 g/L菌體接入量加入活化后的G.oxydansNL71細胞，于30 ℃和220 r/min條件下催化反應(yīng)96 h，每6 h檢測并加入30%的NaOH溶液維持pH值6.0。

1.3.3 不同細胞濃度的全細胞催化 麥稈稀酸預(yù)處理水解液經(jīng)減壓真空濃縮至木糖質(zhì)量濃度100 g/L，以30% NaOH溶液中和至pH值6.0，在250 mL三角搖瓶加入50 mL水解液并分別加入2、4 和8 g/L活化后的G.oxydansNL71細胞，于30 ℃和220 r/min條件下催化反應(yīng)96 h，每6 h檢測并加入30%的NaOH溶液維持pH值6.0。

1.3.4 機械攪拌通氧加壓全細胞催化 麥稈稀酸預(yù)處理水解液經(jīng)減壓真空濃縮至木糖質(zhì)量濃度100 g/L，以30%NaOH溶液調(diào)至pH值6.0，在機械攪拌反應(yīng)體系加入1 L麥稈稀酸水解液并按8 g/L菌體接入量加入活化后的G.oxydansNL71細胞，于30 ℃和500 r/min條件下采取通氧加壓方式催化反應(yīng)24 h，使用30%的NaOH溶液在線調(diào)節(jié)pH值6.0。

1.4 分析檢測及計算方法

1.4.1 糖及糖酸的色譜分析檢測[8]采用離子色譜分析。色譜柱，CarboPacTMPA10(2 mm × 250 mm)；柱溫30 ℃；流動相采用0.2 moL/L NaOH溶液梯度洗脫，流速0.3 mL/min，四電位脈沖安培檢測器(PAD)以外標法檢測；進樣量10 μL。糖利用率=消耗糖含量×100%/初始糖含量；己糖酸(半乳糖酸、葡萄糖酸和甘露糖酸)得率=己糖酸含量×100%/(己糖含量×1.089)；戊糖酸(阿拉伯糖酸和木糖酸)得率=戊糖酸含量×100%/(戊糖含量×1.107)；糖酸產(chǎn)生速率=糖酸含量×100%/催化反應(yīng)時間。

1.4.2 抑制物的色譜分析檢測 采用液相色譜分析抑制物甲酸、乙酸及乙酰丙酸。色譜柱，Aminex Bio-Rad HPX-87H；流動相5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min；柱溫55 ℃；示差折光檢測器溫度30 ℃；進樣量10 μL。

1.4.3 菌體濃度的測定 采用比濁法，取全細胞催化水解液經(jīng)8 000 r/min離心5 min后再以0.9%生理鹽水重復(fù)洗滌2遍，稀釋至一定濃度后在0.5 cm光徑的比色皿中測定600 nm處的吸光度值，即為菌體濃度(OD600)。

1.4.4 鈉離子濃度測定 采用火焰光度法按照按羅馬金公式進行定量分析，取全細胞催化水解液經(jīng)8 000 r/min離心5 min后由0.22 μm濾膜過濾，稀釋1 000倍，再經(jīng)霧化器將試液霧化通過光電系統(tǒng)測量。

2 結(jié)果與討論

2.1 麥稈稀酸水解液成分

麥稈經(jīng)過稀酸水解預(yù)處理并經(jīng)過過濾得到麥稈稀酸水解液，其主要成分如下：木糖26.82 g/L，葡萄糖6.02 g/L，阿拉伯糖4.69 g/L，半乳糖2.63 g/L，纖維二糖2.11 g/L，甲酸1.17 g/L，乙酸2.89 g/L，乙酰丙酸0.12 g/L。由數(shù)據(jù)可以看出在稀酸預(yù)處理液中，主要成分為木聚糖的降解產(chǎn)物木糖；此外木聚糖側(cè)鏈基團阿拉伯糖基在高溫下降解而釋放的阿拉伯糖，少量纖維素在高溫酸性條件下降解成纖維二糖和葡萄糖[9]；降解生成的糖類物質(zhì)以及木質(zhì)素降解的多種單環(huán)芳香族化合物在高溫或酸的作用下還會進一步發(fā)生分解和氧化反應(yīng)，產(chǎn)生有機酸(甲酸、乙酸和少量的乙酰丙酸)、醛類(糠醛、羥甲基糠醛)及芳香族化合物等對微生物生長和代謝具有抑制作用的副產(chǎn)物。這些副產(chǎn)物通過抑制微生物的有氧呼吸、增加細胞膜的透性、破壞酶活性等抑制微生物菌體生長和產(chǎn)物生成，甚至具有致死毒性[12]。

2.2 初始木糖濃度對全細胞催化的影響

為了測試未經(jīng)任何脫毒處理的麥稈稀酸水解液濃度對全細胞催化的影響，選取了不同濃度的麥稈水解液進行實驗，實驗結(jié)果如表1所示。當麥稈水解液木糖質(zhì)量濃度在60～80 g/L之間時,木糖利用率高于90%，木糖酸得率在70%左右。然而，當麥稈水解液濃縮木糖質(zhì)量濃度達100 g/L時，全細胞催化明顯受到抑制，產(chǎn)生的木糖酸質(zhì)量濃度36.5 g/L，殘余木糖質(zhì)量濃度57.1 g/L，木糖酸得率僅32.7%。當濃縮木糖質(zhì)量濃度超過120 g/L，細胞催化幾乎難以維系。

盡管木質(zhì)纖維素預(yù)水解液中的木糖占總糖的70%以上，但是除此之外其中還含有其它多種單糖、低聚糖和抑制物組分，它們對微生物的木糖代謝存在著如糖底物競爭效應(yīng)、膜蛋白與通透性改變、酶活力抑制、關(guān)鍵酶與蛋白質(zhì)基因的表達調(diào)控、細胞生長和遺傳等多方面的影響，并且還可能與發(fā)酵工藝條件形成復(fù)雜的交互效應(yīng)，最終限制木糖的代謝和木糖酸的產(chǎn)出，并且該抑制效應(yīng)在細菌發(fā)酵過程中的表現(xiàn)更加突出[14]。實驗結(jié)果表明，即使在低濃度的水解液中的糖酸催化生產(chǎn)性能也會受到嚴重抑制，此時即使木糖被完全代謝木糖酸的得率仍低于70%，換言之消耗的木糖并未完全轉(zhuǎn)化為木糖酸。此外，伴隨著秸稈水解液濃度的增加木糖酸得率明顯下降?；贕.oxydans的細胞代謝特征，分析認為：在低濃度麥稈稀酸水解液中，G.oxydans可能會通過Dahms途徑消耗部分木糖或木糖酸[15]，用以維持細胞生長或碳骨架分解以抵御抑制物的抑制作用；而隨著秸稈水解液濃度增加抑制物含量也隨之增加，最終使得G.oxydans的細胞活性被嚴重抑制，僅能夠在細胞催化初期利用細胞膜上原有的木糖脫氫酶，表現(xiàn)出對木糖的基本催化能力,僅有木糖酸產(chǎn)出且得率低于10%。

表1 不同初始木質(zhì)纖維水解液質(zhì)量濃度催化反應(yīng)結(jié)果對比

2.3 細胞濃度對全細胞催化的影響

在微生物發(fā)酵過程中采用高接種量可以縮短菌體調(diào)整適應(yīng)期，使產(chǎn)物生成高峰提前，并可減少雜菌污染風(fēng)險。同時，利用生物的種群體密度及感應(yīng)效應(yīng)(如種內(nèi)互助)還可以有效消減抑制效應(yīng)，提高微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)性能。在含100 g/L木糖的麥稈水解液中分別加入2、 4和8 g/L 的G.oxydans細胞催化反應(yīng)96 h，以考察高濃度細胞接入是否能改變高濃度水解液對全細胞催化的抑制作用，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同細胞濃度對全細胞催化的影響

結(jié)果表明，當接種量為2、4和8 g/L時，催化反應(yīng)96 h產(chǎn)生的木糖酸質(zhì)量濃度分別為36.5、 73.3和94.9 g/L。相比于接種量為2 g/L，當接種量為4 和8 g/L時木糖酸的產(chǎn)量分別提高了約1倍和1.6倍。由數(shù)據(jù)可知隨接種量的增大，木糖酸產(chǎn)生速率也隨之加快，48 h接種量8 g/L時木糖酸得率85.7%，產(chǎn)生速率為1.98 g/(L ·h)，相對于2和4 g/L接種量產(chǎn)生速率提高了約1.6倍與0.3倍。分析認為，菌體細胞本身對抑制物(如：醛類、酚類及芳香族化合物)具有一定吸附或氧化能力[16]，因而通過提高G.oxydans菌體細胞接入量能夠消減抑制物對菌體的毒性及提高細胞對鈉鹽的耐受性從而提高細胞的催化性能。

2.4 通氧加壓對全細胞催化性能的影響

圖2 通氧加壓條件下，麥稈水解液全細胞催化反應(yīng)歷程

G.oxydans屬于嚴格好氧菌,在全細胞催化過程中需要高通風(fēng)量提供充足的氧以用于完成氧化反應(yīng)，而木質(zhì)纖維素水解液通常除了含有多種糖類，還含有許多膠質(zhì)、有機氮源、脂質(zhì)及木質(zhì)素等復(fù)雜化合物，在通風(fēng)條件下極易產(chǎn)生泡沫造成傳氧阻力、料液逸罐和雜菌污染等問題，需要添加大量的消泡劑；另外，木糖轉(zhuǎn)化為木糖酸時會迅速降低培養(yǎng)體系的pH值并最終抑制細胞的催化反應(yīng)，因此在工業(yè)生產(chǎn)中必須建立實時在線的中和技術(shù)。為解決上述關(guān)鍵性障礙，徐勇等[17]提出一種通氧加壓全細胞催化體系，即用高純度的氧氣加壓的專利技術(shù)代替空氣直接通入密封的全細胞反應(yīng)體系，在此反應(yīng)體系中，并采用CaCO3進行在線中和，首次實現(xiàn)了木質(zhì)纖維水解液的特高濃度的高效轉(zhuǎn)化[10]，但是在反應(yīng)過程中CaCO3中和木糖酸所生成的CO2仍然需要定期排放操作。利用該技術(shù)原理，以NaOH溶液替代 CaCO3作為木糖酸的中和劑，期望能夠解決CO2的定期排放操作不便的問題。在3 L密封加氧的機械攪拌式反應(yīng)器中，以含100 g/L木糖的麥稈稀酸水解液為原料接入8 g/LG.oxydans菌體，使用30% NaOH溶液在線調(diào)控pH值6.0得到的木糖酸全細胞催化反應(yīng)歷程如圖2所示。結(jié)果表明：在一定的木糖濃度范圍內(nèi)，完全可以采用NaOH溶液替代 CaCO3作為木糖全細胞催化產(chǎn)木糖酸的中和劑，避免了CaCO3中和的CO2廢氣生成與排放問題，顯著簡化了生產(chǎn)操作。盡管麥稈水解液鈉離子質(zhì)量濃度超過20 g/L，由表2可看出只需反應(yīng)24 h木糖利用率就可以接近100%。

表2給出了機械攪拌體系反應(yīng)24 h的結(jié)果及其與搖瓶體系結(jié)果的對比，由表2可知，在機械攪拌體系中產(chǎn)生的木糖酸質(zhì)量濃度為103.1 g/L，對應(yīng)的產(chǎn)品得率達93.1%，產(chǎn)生速率達到4.29 g/(L ·h)，同比為搖瓶反應(yīng)體系的1.6倍。于此同時,G.oxydans細胞也能夠同步催化氧化阿拉伯糖和半乳糖生成相應(yīng)的糖酸(鈉)。由此可見，與搖瓶體系相比，采用通氧加壓反應(yīng)體系可以大幅度提高溶解氧水平從而促進細胞呼吸作用及提高氧化酶的催化反應(yīng)動力學(xué)，最終使G.oxydans細胞成功克服木質(zhì)纖維水解液中復(fù)雜抑制效應(yīng)，實現(xiàn)木質(zhì)纖維原料稀酸水解液中包括木糖在內(nèi)的阿拉伯糖、半乳糖等半纖維素糖類組成的糖酸轉(zhuǎn)化。通過半纖維素糖類的全細胞共催化生產(chǎn)多糖酸產(chǎn)品，進而帶動和實現(xiàn)原料中半纖維素的分類高效生物轉(zhuǎn)化與利用，整體提升木質(zhì)纖維資源生物煉制的原料全值化利用水平及經(jīng)濟效益。

表2 搖瓶及機械攪拌體系催化反應(yīng)24 h結(jié)果對比

3 結(jié) 論

3.1 通過對不同初始濃度水解液G.oxydans催化性能的研究，表明未脫毒水解液對催化反應(yīng)生產(chǎn)木糖酸具有抑制作用，且隨濃度提高，抑制作用增強。

3.2 提高細胞接入量可以提高G.oxydans細胞對抑制物的拮抗效應(yīng)及對鈉鹽的耐受性從而提高了細胞催化水平及木糖酸產(chǎn)量。采用8 g/L的G.oxydans直接催化含100 g/L木糖的麥稈稀酸水解濃縮液，48 h時木糖酸得率可達到85.7%，產(chǎn)生速率1.98 g/(L ·h)。

3.3 利用機械攪拌通氧加壓與高細胞濃度相結(jié)合的全細胞催化技術(shù)可以進一步顯著提高木糖酸的得率，并且可以實現(xiàn)NaOH在線中和技術(shù)以避免加入CaCO3中和而造成的CO2排放問題。采用8 g/L的G.oxydans細胞直接催化100 g/L麥稈水解液24 h的木糖酸得率為93.1%，產(chǎn)生速率達到4.29 g/(L ·h)，為搖瓶體系的1.6倍。

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Production of Xylonic Acid from Dilute Sulfuric Acid Hydrolysates of Wheat Straw with Whole-cell Catalysis ofGlucobacteroxydans

MA Yi-cong1, ZHOU Xin1,2, MIAO Yuan-yuan1,2, XU Yong1,2, YONG Qiang1,2, YU Shi-yuan1,2

(1.College of Chemical Engineering,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2.Jiangsu Key Laboratory of Biomass-based Green Fuels and Chemicals,Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

The production of xylonic acid from hydrolysates of straw by whole-cell catalysis was investigated with long-term domesticatedGluconobacteroxydansas catalytic strain.The results showed that the catalytic reaction could be inhibited by hydrolysates without detoxication,and the inhibitory effect was more obvious with the increase of concentration.However,it could be counteracted by increasing inoculation quantity and dissolved oxygen.In the shake flask system,with the inoculation amount of 2 g/L and the xylose concentration of hydrolysates more than 100 g/L,the performance of cell catalysis was inhibited seriously,and the yield of xylonic acid and utilization rate of xylose were all lower than 50%.When the inoculation amount increased to 8 g/L,the yield of xylonic acid reached 85.7%.The method of compressed oxygen supply in the sealed aerated stirred tank reactor was investigated,and in 24 h the concentration and yield of xylonic acid reached 103.1 g/L and 93.1%,respectively.And the production rate increased 1.6 folds compared with that of the shaker system when xylose concentration of hydrolysates was 100 g/L and inoculation amount ofG.oxydanswas 8 g/L.

xylonic acid;xylose;whole cell catalysis；Glucobateroxydans;straw hydrolysates

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.02.005

2015- 01- 16

國家自然科學(xué)基金資助項目(31370573);國家863計劃資助(2012AA022304)；江蘇研究生創(chuàng)新課題(KYLX_0880) 作者簡介：麻藝聰(1993—)，陜西渭南人，本科生，研究方向：植物纖維資源生物煉制

TQ35

A

1673-5854(2015)02- 0021- 06

*通訊作者：徐 勇，教授，博士生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域：植物纖維資源生物煉制；E-mail:xuyong@njfu.edu.cn。