張秋芳，譚 艷，汪選斌，潘龍瑞，李洪亮，劉 慧，向繼洲，付 琴

（1．華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系，湖北武漢 430071；2．湖北醫(yī)藥學(xué)院藥理教研室，湖北十堰 442000；3．湖北醫(yī)藥學(xué)院武當(dāng)特色中藥湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北十堰 442000）

RISK信號(hào)通路在β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑Clenbuterol減輕心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷中的作用

張秋芳1，2，3，譚 艷2，汪選斌3，潘龍瑞2，李洪亮3，劉 慧1，向繼洲1，付 琴1

（1．華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系，湖北武漢 430071；2．湖北醫(yī)藥學(xué)院藥理教研室，湖北十堰 442000；3．湖北醫(yī)藥學(xué)院武當(dāng)特色中藥湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北十堰 442000）

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：R-332；R322.11；R329.24；R392.11；R345.57；R845.22

摘要：目的 研究β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑clenbuterol對(duì)原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷的作用及其是否與激活再灌注損傷挽救激酶（reperfusion injury salvage kinase，RISK）信號(hào)通路有關(guān)。方法 將原代培養(yǎng)的新生Wistar大鼠乳鼠心肌細(xì)胞分為8組，①正常培養(yǎng)組；②缺氧／復(fù)氧（A／R）組；③clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R；④ICI118，551（10 μmol ·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組；⑤美托洛爾metoprolol（10 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組；⑥metoprolol（10μmol·L－1）＋A／R組；⑦PD98059 （20 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組；⑧LY294002（10 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組。采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞存活率；比色法檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)液的乳酸脫氫酶（LDH）含量；Hoechst 33342熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；分子探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平；Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧后ERK及 p-ERK1／2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與A／R組比較，clen-buterol＋A／R組明顯增高細(xì)胞存活率，降低LDH含量，降低細(xì)胞凋亡率，ROS產(chǎn)生減少，p-ERK1／2蛋白表達(dá)水平增高，而選擇性β2受體阻斷劑ICI 118，551可取消clenbuterol的上述作用，β1受體阻斷劑Metoprolol對(duì)clenbuterol的作用無(wú)影響，PI3K抑制劑LY294002和ERK1／2抑制劑PD98059可阻斷clenbuterol對(duì)心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。結(jié)論 clenbuterol能夠減輕心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷，加入選擇性β2受體阻斷劑ICI 118，551，PI3K抑制劑LY294002和ERK抑制劑PD98059均使clenbuterol的保護(hù)作用取消，表明clenbuterol可通過(guò)激動(dòng)β2腎上腺素受體，激活RISK信號(hào)

通路發(fā)揮抗心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷的作用。

關(guān)鍵詞：clenbuterol；缺氧／復(fù)氧；心肌細(xì)胞；磷酸化ERK；PI3K；reperfusion injury salvage kinase（RISK）

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．018．html

研究表明，再灌注損傷挽救激酶（reperfusion in-jury salvage kinase，RISK）信號(hào)系統(tǒng)，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、磷酸肌醇3激酶（PI3K）－蛋白激酶Akt途徑，p38及絲氨酸激酶JNK等［1］，在缺血／再灌中對(duì)心肌細(xì)胞起重要的保護(hù)作用，是治療急性心梗（acute myocardial infarction，AMI）的新靶點(diǎn)。在再灌初期，加入PI3K的抑制劑可取消缺血后處理（ischemic postconditioning）的心肌保護(hù)作用［2］。ERK抑制劑也會(huì)取消缺血預(yù)適應(yīng)（ischemic precon-ditioning）的心肌保護(hù)作用［3］，提示再灌注后的補(bǔ)救激酶系統(tǒng)在缺血／再灌損傷中起著重要的保護(hù)作用，

也是缺血預(yù)適應(yīng)與缺血后處理共同激活的激酶系統(tǒng)［2，4－5］，是缺血預(yù)適應(yīng)與缺血后處理提供保護(hù)作用的共同通路。RISK信號(hào)系統(tǒng)的上游是G蛋白偶聯(lián)受體［1］，而β受體是GPCRs家族中的一員，提示β受體可能在保護(hù)心肌缺血／再灌注損傷中起重要的作用。克倫特羅（clenbuterol，Clen）作為β2受體激動(dòng)劑，對(duì)血管、支氣管、子宮平滑肌都有舒張作用［6］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，clenbuterol對(duì)心肌細(xì)胞具有促“生理”性增生肥大作用［7］。而對(duì)右心衰后右心收縮功能有改善作用。臨床上已將clenbuterol應(yīng)用于心力衰竭患者除去左室輔助裝置后的恢復(fù)治療［8］。雖然Burniston等［9－10］報(bào)道clenbuterol可誘導(dǎo)正常健康大鼠心肌出現(xiàn)凋亡，但Xydas等［11］和Ahmet等［12］發(fā)現(xiàn)clenbuterol及其他選擇性β2受體激動(dòng)劑fenoterol或zinterol等可改善冠脈左前降支（LAD）結(jié)扎后的心室舒張功能。Clenbuterol還可減少缺血性心肌病左室重塑，降低心肌細(xì)胞凋亡，改善鈣穩(wěn)態(tài)等；另外，clenbuterol還可上調(diào)暫時(shí)性前腦缺血模型中的Bcl-2／Bax［13］。而本課題組已經(jīng)報(bào)道clenbuterol對(duì)缺血／再灌注的心肌細(xì)胞有抗凋亡作用［14－15］，但clenbuterol對(duì)缺血／再灌注損傷的保護(hù)作用是否與RISK通路有關(guān)，需進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)擬采用原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞，建立缺氧／復(fù)氧實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵阅M缺血／再灌注損傷，觀察clenbuterol對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷的作用，并采用PI3K／Akt抑制劑LY294002和ERK1／2抑制劑PD98059，探索clen-buterol對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷的保護(hù)作用是否與RISK信號(hào)通路有關(guān)。

1　材料與方法

1．1藥品與試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)CS）購(gòu)自杭州四季青公司；胰蛋白酶購(gòu)自Amerco公司；PD98059 （167869-21-8）和LY294002（154447-36-6）購(gòu)自Pro-mega corporation公司；ICI 118，551、克倫特羅（clen-buterol）（批號(hào)：MFCD00083280）、膠原酶I（批號(hào)：MFCD00130830）和Hoechst33342（批號(hào)：MFCD00012678）購(gòu)自Sigma；LDH試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；ROS試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；其他試劑均為市售分析純。

1．2乳鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取新生1～2 d Wist-ar乳鼠（由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供），在無(wú)菌條件下，在其劍突下剪開(kāi)十字切口，取下心臟下1／3，用預(yù)冷D-Hanks洗去殘血，將心肌組織剪碎，并用冷D-Hanks清洗3遍，加入0.08%胰酶37℃消化1次，然后以0.08%膠原酶37℃消化數(shù)次，每次10 min，棄去第1次消化所得上清液，收集其余幾次消化所得上清液，以1∶1（體積）加入含10%胎牛血清高糖DMEM終止消化，1 000 r· min－1離心10 min，棄去上清，以含10%胎牛血清高糖DMEM重懸細(xì)胞，接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，用差速貼壁法于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min，使成纖維細(xì)胞貼壁，然后轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至2×108·L－1，并加入終濃度為0.1 mmol·L－15-Br-dU（Sigma-Aldrich）以抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，接種至24、96或6孔板內(nèi)，置入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)3 d后，更換無(wú)血清的培養(yǎng)基同步化12h開(kāi)始做實(shí)驗(yàn)。

1．3建立心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧（anoxia／reoxygen-ation，A／R）損傷模型 心肌細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合狀態(tài)，呈現(xiàn)同步搏動(dòng)時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。模擬缺血溶液（mmol·L－1：NaCl 98.5，KCl 10，NaCl 98.5，KCl 10，MgSO41.2，CaCl21.0，HEPES 20，sodium lac-tate 40，pH 6.8）。以95%N2＋5%CO2預(yù)飽和1 h，將培養(yǎng)的細(xì)胞以擬缺血溶液置換無(wú)血清的培養(yǎng)基，并置于95%N2＋5%CO2，37℃的密閉容器中，持續(xù)正壓通混合氣95%N2＋5%CO2，為心肌細(xì)胞缺氧即缺血；然后恢復(fù)心肌細(xì)胞的有糖復(fù)氧液（mmol· L－1：NaH2PO40.9，NaHCO320.0，CaCl21.0，Mg-SO41.2，HEPES 20.0，NaCl 129.5，KCl 5.0，glu-cose 5.5，pH 7.4，37℃）［16］于37℃，95%空氣＋5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，為心肌細(xì)胞復(fù)氧即再灌。心肌細(xì)胞缺氧培養(yǎng)4 h和復(fù)氧培養(yǎng)2 h后做相應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。

clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R組。

1．5MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 細(xì)胞存活率通過(guò)活細(xì)胞中線(xiàn)粒體琥珀酸脫氫酶將MTT還原紫色結(jié)晶物甲（Formazan）的量來(lái)判斷。按實(shí)驗(yàn)分組作相應(yīng)處理，處理結(jié)束后，每孔加入終濃度為0.5 g·L－1MTT，37℃孵育4 h后，吸棄上清液，PBS洗1次，加入150 μL DMSO，待結(jié)晶完全溶解后，以620 nm為參比，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm測(cè)定吸光度值（OD），按公式：細(xì)胞存活率／%＝（測(cè)定孔OD－空白孔OD）／（對(duì)照孔OD－空白孔OD）×100%。

1．6培養(yǎng)液中LDH測(cè)定 造模給藥處理后收集培養(yǎng)液，按LDH試劑盒說(shuō)明操作，采用化學(xué)比色法測(cè)定LDH的釋放量。

1．7ROS的測(cè)定 原代心肌細(xì)胞按上述實(shí)驗(yàn)分組處理結(jié)束后，用溫HBSS／Ca／Mg液輕柔洗心肌細(xì)胞1次，96孔板每孔加入100 μL的終濃度為10 μmol ·L－1的DCFH-DA，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，用溫HBSS／Ca／Mg液輕柔洗心肌細(xì)胞3次，用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，DCFH-DA波長(zhǎng)選擇Ex／Em：488／525 nm。陽(yáng)性對(duì)照孔中加入終濃度100 μmol·L－1的H2O2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h。

1．8Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞P-ERK的水平經(jīng)處理后用RIPA裂解細(xì)胞，BCA法蛋白定量。將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%牛血清蛋白（BSA）室溫封閉1 h，加入p-ERK 和ERK2一抗，4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1h。加入ECL反應(yīng)體系，曝光，成像，利用Syngene凝膠成像分析系統(tǒng)，計(jì)算磷酸化蛋白與總蛋白的比值。

1．9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD（least sig-nificant difference）檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2．1不同濃度的clenbuterol對(duì)缺氧／復(fù)氧后心肌細(xì)胞存活率的影響 結(jié)果顯示，缺氧／復(fù)氧組與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率降低（60.40%±1.60%，P ＜0.01）。而不同濃度的clenbuterol（0.1、1、10 μmol·L－1）＋A／R組與A／R組相比，只有clen-buterol（1 μmol·L－1）＋A／R組的細(xì)胞存活率與A／R組間差異有顯著性（70.67%±4.81%vs 60.40%±1.60%，P＜0.05），這為clenbuterol濃度的選擇提供依據(jù)（Fig 1）。

班主任擔(dān)負(fù)著教書(shū)和育人的雙重任務(wù)，對(duì)學(xué)生的個(gè)性心理品質(zhì)培養(yǎng)，行為習(xí)慣的培養(yǎng)，以及學(xué)習(xí)態(tài)度培養(yǎng)起著巨大的作用。因此，讓每一個(gè)班主任上崗前就具備扎實(shí)的理論知識(shí)和先進(jìn)的管理理念，不能再摸著石頭過(guò)河，這樣浪費(fèi)的是學(xué)生的時(shí)間，同時(shí)有可能讓學(xué)生喪失學(xué)習(xí)的興趣。

2．2clenbuterol對(duì)缺氧／復(fù)氧后心肌細(xì)胞存活率和LDH的影響 缺氧／復(fù)氧組與正常對(duì)照組相比細(xì)胞存活率明顯降低，培養(yǎng)液中LDH釋放量增高（P＜ 0.01）；clenbuterol＋A／R組、metoprolol＋A／R組和clenbuterol＋metoprolol＋A／R組與A／R組相比，細(xì)胞存活率增高，LDH釋放量減少（P＜0.05）；而ICI 118，551＋clenbuterol＋A／R組與A／R組差異無(wú)顯著性（Fig 2、3）。

Fig 1 Effect of different concentrations of clenbuterol on viability of cardiomycytes subjected to 4 h of anoxia／2h of reoxygenation（A／R）

Fig 2 Effect of clenbuterol，Metoprolol and in combination on viability of cardiomycytes subjected to 4 h of anoxia／2h of reoxygenation（A／R）．Cell viability was measured by MTT assay as decribed in the material and｜methods section

2．3clenbuterol對(duì)缺氧／復(fù)氧后心肌細(xì)胞ROS產(chǎn)生的影響 正常培養(yǎng)組心肌細(xì)胞只產(chǎn)生少量ROS，缺氧／復(fù)氧組ROS明顯增加（與正常培養(yǎng)組相比，P ＜0.01）；clenbuterol＋A／R組，metoprolol＋A／R組，clenbuterol＋metoprolol＋A／R組與A／R組相比較，ROS產(chǎn)生明顯減少（與缺氧／復(fù)氧組比較，P＜

0.05）；ICI 118，551＋clenbuterol＋A／R組與A／R組相比差異沒(méi)有顯著性（P＞0.05），但與clenbuterol＋A／R組相比，ROS明顯增高；而clenbuterol＋meto-prolol＋A／R組與clenbuterol＋A／R組相比較，差異無(wú)顯著性（Fig 4）。

Fig 3 Effects of Metoprolol，clenbuterol and clenbuterol combination with ICI or Metoprolol on LDH activity in cardiomyocytes subjected to anoxia／reoxygenation（A／R）

Fig 4 Effects of clenbuterol，metoprolol，and clenbuterol combination with ICI or Metoprolol on the formation of ROS induced by A／R in cardiomyocytes

2．4ERK抑制劑PD98059對(duì)clenbuterol抗缺氧／復(fù)氧后心肌細(xì)胞損傷的影響 為了進(jìn)一步探討ERK1／2途徑是否參與clenbuterol對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)預(yù)先給予ERK1／2抑制劑PD98059，采用MTT法檢測(cè)缺氧／復(fù)氧后心肌細(xì)胞的存活率，用Hoechst熒光染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，缺氧／復(fù)氧組與正常培養(yǎng)組比較，細(xì)胞生存率下降至63%，凋亡率升高至48%。而給予clen-buterol后，缺氧／復(fù)氧后存活率上升至70%，凋亡率降低24.6%，但預(yù)先加入PD98059后，細(xì)胞存活率下降至56%，凋亡率（50.8%）比clenbuterol＋A／R組高，并差異具有顯著性（P＜0.05）。（Fig 5、6）。

2．5PI3K抑制劑LY294002對(duì)clenbuterol抗缺氧／復(fù)氧后心肌細(xì)胞損傷的影響 為了進(jìn)一步觀察PI3K／Akt途徑是否參與clenbuterol對(duì)缺氧／復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)預(yù)先給予PI3K抑制劑LY294002，MTT法檢測(cè)缺氧／復(fù)氧后的存活率和Ho-echst熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。與正常培養(yǎng)組相比，缺氧／復(fù)氧組細(xì)胞存活率明顯下降，凋亡率明顯上升（P＜0.01）。而預(yù)先給予clenbuterol后，細(xì)胞存活增加，凋亡率下降。但預(yù)加入LY294002后，clen-buterol對(duì)缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用被取消（Fig 5、6）。

Fig 5 Effects of clenbuterol and combination with LY294002（LY）or PD98059（PD）on viability of cardiomyocytes subjected to anoxia／reoxygenation（A／R）

2．6對(duì)心肌細(xì)胞p-ERK的表達(dá)水平的影響 各組缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞ERK2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但缺氧／復(fù)氧組p-ERK蛋白水平比正常培養(yǎng)組降低，而clenbuterol＋A／R組較缺氧／復(fù)氧組p-ERK蛋白水平明顯增高（P＜0.01），加入ERK1／2阻斷劑PD98059后，p-ERK蛋白表達(dá)水平明顯降低；而PI3K／Akt阻斷劑LY294002對(duì)clenbuterol誘導(dǎo)的ERK磷酸化無(wú)阻斷作用（Fig 7）。

Fig 6 Effects of Clenbuterol and combination with LY294002（LY）or PD98059（PD）on A／R-induced apoptosis as stained by Hoechst 33342

Fig 7 Effects of clenbuterol and combination with LY294002（LY）or PD98059（PD）on the expressions of p-ERK1／2 in cardiomyocytes subjected to anoxia／reoxygenation（A／R）．

3　討論

有研究表明，心肌缺血／再灌注損傷涉及多方面因素，如自由基大量堆積、細(xì)胞內(nèi)超載、炎癥因子釋放等。心肌缺血／再灌注過(guò)程，大量的氧自由基爆發(fā)式產(chǎn)生，氧自由基通過(guò)過(guò)氧化生物膜上的多價(jià)不飽和脂肪酸和產(chǎn)生的過(guò)氧化物損傷心肌細(xì)胞膜，并刺激線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C釋放，后者進(jìn)一步激活Caspase信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。LDH是細(xì)胞損傷程度的標(biāo)志。正常生理情況下，LDH存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，只有當(dāng)細(xì)胞膜受損，通透性發(fā)生改變時(shí)，LDH才會(huì)外漏，所以通常檢測(cè)LDH評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧／復(fù)氧后心肌細(xì)胞存活率降低，LDH釋放增多，表明缺氧／復(fù)氧后心肌受到嚴(yán)重?fù)p傷，ROS產(chǎn)生增多，給予clenbuterol可增加原代培養(yǎng)新生大鼠乳鼠的心肌細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷存活率，減少LDH釋放量，降低ROS，這說(shuō)明β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑clenbuterol可通過(guò)減少氧自由基的產(chǎn)生，降低缺氧／復(fù)氧損傷，從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，而β2-腎上腺素受體阻斷劑ICI 118，551可以取消上述作用，而β1-腎上腺素受體阻斷劑美托洛爾不能阻斷clenbuterol的作用，但兩者之間也無(wú)協(xié)同作用，表明clenbuterol是通過(guò)激動(dòng)β2-腎上腺素受體而對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

RISK信號(hào)系統(tǒng)包括PI3K-Akt和ERK途徑［18］。Tong等［2］首次確定PI3K-Akt途徑的作用，在離體再灌心臟模型發(fā)現(xiàn)預(yù)適應(yīng)能增加Akt的磷酸化，而其磷酸化抑制劑wortmannin和LY294002能取消缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1／2）是MAPK家族中的一員，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、存活。缺血／再灌、低氧或激動(dòng)β受體等可活化ERK1／2。雖然有少部分學(xué)者對(duì)p-ERK在缺血后再灌中的有爭(zhēng)議；大部分學(xué)者都認(rèn)為激活ERK有利于細(xì)胞的存活，如ERK磷酸化也參與了缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用［19］，而MEK-1抑制劑PD98059也可取消缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用。RISK的上游是G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）。研究表明，許多藥物或內(nèi)源肽（如Urocorin、腎上腺

髓質(zhì)素等）都可通過(guò)激活GPCR，從而激活RISK從而對(duì)缺血／再灌后損傷的心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。而β受體是GPCRs家族中的一員，提示β受體可能在保護(hù)心肌缺血／再灌注損傷中起重要的作用。Stevens等［20］研究表明，clenbuterol主要通過(guò)β2-AR／Gi信號(hào)途徑，改善心肌病理性損傷，減輕凋亡。Lochner等［21］研究發(fā)現(xiàn)，Isopreterol提供的心肌保護(hù)作用與缺血預(yù)適應(yīng)相似［21］。Tong等［22］也證明在β2受體被敲除的小鼠心肌，缺血預(yù)適應(yīng)并不能保護(hù)心肌細(xì)胞。Hedin等［23］研究表明：在培養(yǎng)的成熟大鼠心肌細(xì)胞，β2受體激動(dòng)劑的抗凋亡作用可能是通過(guò)激活ERK。最近研究報(bào)道，選擇性β2-受體激動(dòng)劑Zinterol對(duì)原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌低氧和H2O2引起的凋亡有保護(hù)作用，并且是通過(guò)Gi偶聯(lián)受體，激活下游的PI3K／Akt發(fā)揮效應(yīng)的［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，clenbuterol在保護(hù)缺氧／復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的同時(shí)，亦可提高p-ERK1／2水平，而應(yīng)用ICI118551阻斷β2受體或LY294002阻斷PI3K／Akt通路或PD98059阻斷ERK1／2信號(hào)通路，均可明顯抑制clenbuterol對(duì)心肌的保護(hù)作用，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率下降，LDH釋放量增高，細(xì)胞凋亡率增加。

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用病例都證實(shí)，β1受體拮抗劑具有抗氧化、抗凋亡和膜穩(wěn)定作用，對(duì)缺血／再灌心肌有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞缺氧－復(fù)氧模型單獨(dú)給予metoprolol中可提高細(xì)胞存活率，降低LDH及ROS，減少心肌細(xì)胞凋亡。這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，但與clenbuterolol聯(lián)合應(yīng)用既不能抑制clenbuterolo對(duì)缺氧／復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，也無(wú)協(xié)同抗心肌細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述，clenbuterol對(duì)缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與激動(dòng)β2-AR，激活RISK信號(hào)通路有關(guān)，關(guān)于clenbuterol對(duì)其通路上下游蛋白的影響，本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行驗(yàn)證，仍需進(jìn)一步研究。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在華中科技大同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理系向繼洲實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師與同學(xué)提供的大力幫助。）

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Role of RISK signal pathway in reducing clenbuterol-induced cardiomycytes A／R injury of neonatal rat

ZHANG Qiu-fang1，2，3，TAN Yan2，WANG Xuan-bin3，PAN Long-rui2，LI Hong-liang3，LIU Hui1，XIANG Ji-zhou1，F(xiàn)U Qin1
（1．Dept of Pharmacology，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430071，China；2．Dept of Pharmacology，Hubei University of Medicine，Shiyan Hubei 442000，China；3．Hubei Key Laboratory of Wudang Local Chinese Medicine Research（Hubei University of Medicine，Shiyan Hubei 442000 China）

Abstract：Aims To study the effects of clenbuterol on anoxia／reoxygenation（A／R）injury in neonatal Wistar rat cardiomyocytes and to explore whether its mecha-nism is related to reperfusion injury salvage kinase （RISK）or not．Methods The cultured primary neo-natal cardiomyocytes were randomly divided into eight groups：①normal culture group；②anoxia／reoxygen-ation（A／R）group；③clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R；④ICI118，551（10 μmol·L－1）＋clenbuterol （1 μmol·L－1）＋A／R；⑤Metoprolol（10μmol· L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R group；⑥Metoprolol（10 μmol·L－1）＋A／R group；⑦PD98059（20 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol· L－1）＋A／R group；⑧LY294002（10 μmol·L－1）＋clenbuterol（1 μmol·L－1）＋A／R group．Cell via-bility was determined by the conventional MTT reduc-tion assay．The content of LDH in cultured medium was measured with colorimetry．Cardiomyocyte apopto-sis was determined by Hoechst33342．Intracellular re-active species（ROS）were monitored by the fluorescent DCFH-DA．Total ERK2 and phosphorylated ERK were detected by western blot．Results Compared with A／R group，clenbuterol significantly increased vaibility of cells，reduced LDH release，lowered the rate of apop-tosis and ROS production．When added β2receptor an-tagonist ICI118，551，PI3K inhibitor LY294002 and ERK inhibitor PD98059，the effects of clenbuterol a-bove were inhibited；but β1 receptor antagonist Meto-prolol protected the cardiomyocytes from A／R injury，as evidenced by decreased LDH release and increased cell viability．There were no synergistic effects in the combined use of clenbuterol and Metoprolol．Conclu-sion clenbuterol exerts cardioprotective effects against A／R injury by inhibiting oxidative stress and apopto-sis．The protection of clenbuterol is inhibited by ICI118，551，LY294002 and PD98059．clenbuterol protects cardiomyocytes against A／R injury via RISK pathway by activation of β2receptor．

Key words：clenbuterol；anoxia／reoxygenation；car-diomyocyte；phosphorylation extracellular signal-activa-ted kinase（ERK）；PI3K；reperfusion injury salvage kinase（RISK）

作者簡(jiǎn)介：張秋芳（1973－），女，博士，副教授，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：zqf1112000＠163．com；付 琴（1974－），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：fu＿qin＠aliyun．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81303254，81102438）；湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（No D20122402）；湖北醫(yī)藥學(xué)院項(xiàng)目（No 2010QDJ12和2012GPY11）；武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（No WDCM003）

收稿日期：2015－06－29，修回日期：2015－08－05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）10－1368－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．009