余 薇，閔 清，郭 霜

（湖北科技學(xué)院1．糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2．藥學(xué)院藥理教研室，湖北咸寧 437100）

NADPH氧化酶在高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷中的作用

余 薇1，2，閔 清2，郭 霜1

（湖北科技學(xué)院1．糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2．藥學(xué)院藥理教研室，湖北咸寧 437100）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R322．11；R329．25；R542．202．3；R587.2

摘要：目的 探討還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NAD-PH）氧化酶在高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞中的作用。方法 不同濃度（5.5、11、22、33、44、55 mmol·L－1）高糖刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h及33 mmol·L－1濃度高糖刺激H9c2心肌細(xì)胞（0、12、24、36、48、72 h），MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率；West-ern blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax以及NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox以及p67phox的表達(dá)水平。結(jié)果 33 mmol· L－1濃度高糖刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率開始明顯下降，Bcl-2表達(dá)減少，而Bax表達(dá)增加（P＜0.05）；此外，NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox以及p67phox蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論 心肌細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶活性升高可能是介導(dǎo)高糖損傷心肌細(xì)胞的重要機(jī)制。

關(guān)鍵詞：心肌細(xì)胞；高糖；糖尿病心肌病；NADPH氧化酶；氧化應(yīng)激；凋亡

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－9－14 14：53 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150914．1453．022．html

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是由糖尿病引起的一種心臟結(jié)構(gòu)和功能障礙，獨(dú)立于高血壓、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心臟瓣膜病及其他已知心臟疾?。?］。DCM的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明，現(xiàn)有研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病患者非缺血性心力衰竭發(fā)生的重要原因［2］。有研究顯示，糖尿病氧化應(yīng)激水平升高與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NAD-PH）氧化酶活化相關(guān)［3］。本研究擬觀察不同時(shí)間高糖刺激對(duì)H9c2心肌細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白以及NAD-PH氧化酶亞單位表達(dá)的影響，探討NADPH氧化酶在高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用，為防治糖尿病心肌細(xì)胞病變提供新的思路。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1細(xì)胞系 H9c2細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心。

1．1．2藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，單克隆Bax和Bcl-2抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，p22phox、p47phox以及p67phox抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1．1．3主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus）；垂直式電泳儀、電轉(zhuǎn)移槽

（美國(guó)Bio-Rad公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；自動(dòng)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)SYNGENE公司）。

1．2方法

1．2．1細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、抗生素（50 kU·L－1青霉素＋50×103g·L－1鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)接近70%融合時(shí)，0.25%EDTA-胰酶消化、傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1．2．2實(shí)驗(yàn)分組 ①H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為：正常對(duì)照組（使用含葡萄糖5.5 mmol·L－1的DMEM培養(yǎng)基），11、22、33、44、55 mmol·L－1高糖培養(yǎng)基刺激24 h組。②H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為：正常對(duì)照組（使用含葡萄糖5.5 mmol·L－1的DMEM培養(yǎng)基）、33 mmol·L－1葡萄糖刺激12、24、36、48、72 h組。

1．3指標(biāo)測(cè)定

1．3．1細(xì)胞存活率檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后棄上清液，每孔加入5 g·L－1MIT工作液30 μL，10%血清培養(yǎng)基270 μL，共同培養(yǎng)4 h，加入DMSO在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的光密度（OD）值。

1．3．2Western blot檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后棄上清，PBS清洗細(xì)胞。每組加入80 μL細(xì)胞裂解液，冰上震蕩裂解30 min。用干凈的細(xì)胞刮刀迅速來(lái)回刮動(dòng)板底細(xì)胞，1.5 mL離心管收集細(xì)胞碎片和裂解液，于4℃下13 000 r·min－1離心15 min。BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每條泳道加蛋白樣品50 μg，根據(jù)不同抗體的效價(jià)，加入用TBST適當(dāng)稀釋的一抗，置于4℃冰箱過夜。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠的IgG抗體，置室溫孵育1 h。用TBST漂洗后，加入ECL熒光液，顯影。

2　結(jié)果

2．1心肌細(xì)胞存活率改變 MTT測(cè)定結(jié)果表明，正常對(duì)照組細(xì)胞存活率以100%參照，高糖可致心肌細(xì)胞存活率隨著高糖濃度以及刺激時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降，心肌細(xì)胞在33 mmol·L－1高糖刺激24 h后存活率開始明顯下降，與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見Fig 1。

2．2心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化 H9c2經(jīng)過高糖處理12 h后，心肌細(xì)胞調(diào)控凋亡的蛋白表達(dá)開始發(fā)生改變，表現(xiàn)為抑制細(xì)胞凋亡的蛋白Bcl-2表達(dá)減少，而促凋亡發(fā)生的蛋白Bax表達(dá)增加，與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示心肌細(xì)胞凋亡的可能已經(jīng)發(fā)生。見Fig 2。

Fig 1 Influence of high glucose on cell viability in H9c2 cardiac cells（n＝10）

Fig 2 Influence of high glucose on the expression of Bcl-2 and Bax in H9c2 cardiac cells（n＝3）

2．3心肌細(xì)胞NADPH氧化酶亞基的變化 為進(jìn)一步探討高糖損害心肌細(xì)胞的可能機(jī)制，我們研究與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的NADPH氧化酶。H9c2細(xì)胞經(jīng)過高糖刺激12 h后NADPH氧化酶亞基p22phox和p47phox表達(dá)水平持續(xù)升高，與正常對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而p67phox蛋白表達(dá)在高糖刺激24 h后持續(xù)升高，與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見Fig 3。

Fig 3 Influence of high glucose on the expression of NADPH submits in H9c2 cardiac cells（n＝3）

3　討論

糖尿病與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，糖尿病是微血管和大血管疾病發(fā)展中的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，糖尿病患者心血管并發(fā)癥引起的死亡率等同于確診心臟病的非糖尿病患者［4］。糖尿病患者在調(diào)整了伴隨著的心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，比如冠心病或者高血壓以后，仍然容易罹患心臟衰竭。DCM作為糖尿病心血管疾病的主要并發(fā)癥之一，早期表現(xiàn)為心肌順應(yīng)性降低和舒張期充盈受阻為主的舒張功能障礙，晚期以收縮功能不全為主，并最終發(fā)展為充血性心力衰竭，重癥患者甚至發(fā)生猝死［5］。

高血糖作為一種獨(dú)立的危險(xiǎn)因素能直接損害心肌［6］。高血糖狀態(tài)下，細(xì)胞外基質(zhì)大量增生、膠原降解異常，心肌間質(zhì)纖維化發(fā)生。纖維化的增加直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致心肌肥大和重構(gòu)，心臟功能受限［7］。心肌細(xì)胞具有不可再生性，隨著凋亡的不斷增加，細(xì)胞外基質(zhì)逐步取代丟失的心肌細(xì)胞，加速心肌纖維化和重構(gòu)進(jìn)程，從而誘發(fā)心衰。糖尿病患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究提示，心肌細(xì)胞凋亡在DCM發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要作用［8－9］。目前認(rèn)為，B細(xì)胞淋巴瘤／白血病-2（Bcl-2）蛋白家族調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［10］。正常情況下，抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2與促細(xì)胞凋亡蛋白Bax維持動(dòng)態(tài)平衡，維持細(xì)胞正常的生理過程。當(dāng)Bcl-2表達(dá)增多，Bax表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡減少，反之凋亡增多。H9c2心肌細(xì)胞株來(lái)源于大鼠胚胎期心臟組織，保持了心肌細(xì)胞的特征，可用于高糖的體外作用研究。本文通過不同濃度葡萄糖刺激H9c2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)33 mmol·L－1高糖可致H9c2存活率明顯降低，且雷梅先等［11］報(bào)道33 mmol·L－1高糖可誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞凋亡。因此，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討高糖損傷心肌的可能機(jī)制。

研究表明，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病患者非缺血性心力衰竭發(fā)生的重要原因，NAD-PH氧化酶是糖尿病心血管組織活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的主要來(lái)源［12］。糖尿病時(shí)，糖脂代謝紊亂不僅使胞質(zhì)戊糖途徑產(chǎn)生的NADPH增多，而且導(dǎo)致線粒體的還原當(dāng)量NADH產(chǎn)生過多，抑制了電子傳遞，從而使NADPH氧化酶以還原當(dāng)量NAD（P）H為底物，將過多的電子傳遞到氧分子產(chǎn)生ROS。已證實(shí)，NADPH氧化酶激活所致ROS產(chǎn)生的增加（即NADPH源性ROS的增加）在糖尿病心肌病中起重要作用［13］。心肌細(xì)胞NADPH氧化酶由gp91phox、p22phox、p47phox、p67phox、p40phox和Rac1 6種亞基組成的復(fù)合體。其中g(shù)p91phox和p22phox亞基位于細(xì)胞質(zhì)膜上，p47phox、p67phox、p40phox、以及Rac1亞基位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。NADPH氧化酶亞基表達(dá)的增加或位于細(xì)胞質(zhì)的亞基向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移的增加均可導(dǎo)致NADPH氧化酶活性的增加［14］。王月芬等［15］研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮通過抑制NADPH氧化酶亞單位p22phox和p47phox的表達(dá)，抑制腎臟氧化應(yīng)激水平，從而對(duì)糖尿病腎病產(chǎn)生保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：高糖刺激H9c2心肌細(xì)胞24 h后NADPH氧化酶亞基p22phox、p47phox以及p67phox表達(dá)持續(xù)增加，且Bcl-2表達(dá)減少而Bax表達(dá)增加，由此提示抑制NADPH氧化酶亞單位的表達(dá)可有效抑制高糖所致的心肌損傷。

綜上所述，高糖刺激時(shí)間的延長(zhǎng)可使H9c2細(xì)胞存活率明顯下降，Bcl-2蛋白表達(dá)減少，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，同時(shí)使NADPH氧化酶亞基的表達(dá)增加。這提示了抑制NADPH氧化酶活性和細(xì)

胞凋亡在糖尿病心血管病并發(fā)癥的預(yù)防和治療具有重要的指導(dǎo)意義。

（致謝：本實(shí)驗(yàn)在湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室的老師對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幫助與指導(dǎo)。）

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Role of NADPH oxidase in high glucose-induced injury in H9c2 cardiac cells

YU Wei1，2，MIN Qing2，GUO Shuang1
（1．Hubei Province Key Laboratory on Cardiovascular，Cerebrovascular，and Metabolic Disorders，Hubei University of Science and Technology，Xianning Hubei 437100，China；2．Dept of Pharmacology，Hubei University of Science and Technology，Xianning Hubei 437100，China）

Abstract：Aim To explore the role of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）oxidase in high glucose-induced injury in H9c2 cardiac cells．Methods H9c2 cardiac cells were exposed to differ-ent concentrations of high glucose（5.5 mmol·L－1，11 mmol·L－1，22 mmol·L－1，33 mmol·L－1，44 mmol ·L－1，55 mmol·L－1）for 24 h and different time pints of high glucose（0 h，12 h，24 h，36 h，48 h，72 h）．Cell viability was measured by MTT colorimetry，the protein expression of Bcl-2，Bax and NADPH oxi-dase submits such as p22phox，p47phoxand p67phoxwere determined by western blotting．Results H9c2 cardi- ac cells exposure to high glucose for 24 h showed on decrease in cell survival and the Bcl-2 expression while an increase in the Bax expression（P＜0.05）．Moreo-ver，high glucose could markedly up-regulate the activ-ity of NADPH oxidase characterized by the enhanced expression of p22phox，p47phoxand p67phox（P＜0.05）．Conclusion Activating NADPH oxidase may play an important role in high glucose-induced injury in H9c2 cells．

Key words：myocardial cells；high glucose；diabetic cardiomyopathy；NADPH oxidase；oxidative stress；ap-optosis

作者簡(jiǎn)介：余 薇（1979－），女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：yuwei0805＠163．com；閔 清（1967－），女，博士，教授，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：873806089＠qq．com

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 2014CFB382）；湖北省教育廳重點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（No D20152802）；湖北科技學(xué)院科研課題（No ZX1305）

收稿日期：2015－07－06，修回日期：2015－08－05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）10－1379－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．10．011