趙豐蘭，段永波，盛　瑋，薛建平

（淮北師范大學生命科學學院/資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽　淮北　235000）

基于降低水稻谷蛋白多成員表達水平的干涉表達載體構建

趙豐蘭，段永波，盛瑋，薛建平

（淮北師范大學生命科學學院/資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽淮北235000）

摘要：通過水稻全基因組比對分析，獲得16個谷蛋白成員信息。序列比對獲得其保守區(qū)域，并選取其中129 bp構建RNAi干涉載體，雙酶切驗證和測序結果表明干涉載體構建成功。

關鍵詞：水稻；谷蛋白；RNAi干涉載體；保守區(qū)域

水稻為全球一半以上人口的主食，對保障全球糧食安全極為重要。同時水稻種子也是目前認為最有潛力作為生物反應器生產重組藥用蛋白的“工廠”之一［1］。目前，限制水稻種子特異表達體系在重組藥用蛋白大規(guī)模應用的主要因子是目標基因表達量過低。外源基因表達受到轉錄、翻譯或翻譯后加工修飾等多層面的協同調控。已用于提高外源基因表達水平的策略包括使用強特異表達啟動子、改善蛋白運輸環(huán)境、提高翻譯效率、特定細胞器儲存等［2 -5］，都一定程度上提高了外源蛋白表達量。這些方法都是針對目的基因表達過程的直接改造以提高表達水平，該類體系已較成熟，如果再想大幅提高外源蛋白的表達量難度較大。

外源基因在表達過程中涉及與內源相關蛋白對氨基酸和存儲空間的直接競爭［6］。2003年，Tada等將轉大豆球蛋白（glycinin）基因的常規(guī)水稻品種與日本晴的低谷蛋白水稻突變體（LGC-1）進行雜交，LGC-1后代中glycinin表達量比其親本日本晴的雜交后代提高120%，達到237 μg/g，暗示突變體中谷蛋白含量的降低提供了更多的氨基酸和空間供glycinin合成［7］。Kuroda等設計了一套包括抑制水稻內源蛋白合成和種子特異表達外源目標基因這2個表達框的植物表達載體，結果發(fā)現內源蛋白含量降低的轉基因水稻種子中綠色熒光蛋白（GFP）表達水平比抑制前顯著增強［8］。Kurokawa等篩選到霍亂毒素B亞基表達量顯著提高的轉基因株系，表明利用外源基因與相關內源基因的競爭關系可提高外源蛋白表達水平，然而關于降低水稻種子內源蛋白含量如何增強外源基因表達尚不清楚［9-10］。

另一方面，水稻種子具有調節(jié)各種內源蛋白組成以保持其總蛋白含量于一定范圍的動態(tài)平衡機制。Maruta等利用RNAi技術降低水稻谷蛋白表達以改良水稻蒸煮品質，結果檢測到種子的其他內源儲藏蛋白含量增加［11］。Kim等在抑制水稻13 kDa醇溶蛋白合成改進營養(yǎng)品質的研究中發(fā)現，該醇溶蛋白顯著降低的同時，其他蛋白含量如10 kDa醇溶蛋白、谷蛋白和伴侶蛋白等增加［12］。綜合分析多個研究組的研究結果，無論低內源蛋白突變體、RNAi降低內源蛋白的水稻種子，還是以二者作為受體表達外源蛋白的種子，均與其野生型在總蛋白含量上無顯著差異，表現為各種內源蛋白或與外源蛋白之間的此消彼長，說明水稻種子各種蛋白組分間存在一種動態(tài)平衡機制，使得其總蛋白含量維持于一恒定范圍［11-14］。

因此，以水稻中谷蛋白所有成員的保守區(qū)域為靶序列，通過RNAi技術降低谷蛋白的含量，可創(chuàng)制低谷蛋白的突變體，為提高外源重組蛋白表達水平奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

日本晴水稻種子由安徽省農業(yè)科學院水稻研究所提供。

植物表達載體pCAMBIA1390RNAi骨架載體、大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α、根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105為淮北師范大學生命科學學院資源植物生物學安徽省重點實驗室課題組保存。

PCR擴增試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司產品，限制性內切酶SacI、StuI、BamHI、MluI、T4 DNA連接酶均購自New England BioLabs （NEB）公司，膠回收試劑盒購自AxyGen Biosciences公司，pMD18-T vector購自TaKaRa生物工程（大連）有限公司，卡那霉素、氨芐青霉素鈉鹽和利福平等購自生工生物工程（上海）股份有限公司，引物和基因合成以及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2方法

1.2.1水稻谷蛋白基因及其保守區(qū)域分析通過NCBI軟件分析水稻全基因組范圍內谷蛋白分布情況，并采用Blast程序對所獲成員的保守區(qū)域進行分析。選定其中部分保守序列作為靶位點設計引物，構建RNAi干涉表達載體（表1）。

表1　RNAi干涉表達載體構建所用引物序列

1.2.2靶片段的獲得及載體構建以日本晴基因組DNA為模板擴增正義和反義靶片段。PCR擴增體系（50μl）如下：5 μl 10×PCR buffer，4 μl 25 mmol MgCl2，4 μl 2.0 mmol dNTPs，2 μl 10 μmol上下游引物，0.4 μl 5 U/μl Taq DNA聚合酶，100 ng DNA模板，ddH2O至50 μl。PCR擴增條件為94℃預變性5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s進行30循環(huán)。PCR產物連接至pMD18-T vector，挑取PCR陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3RfTNFR-Fc種子特異表達載體構建以SacI/StuI對pCAMBIA1390RNAi骨架載體質粒進行雙酶切和含有正義片段的pMD18-T vector載體，回收片段后進行T4DNA酶重組連接；提取所獲陽性菌落質粒進行BamHI/MluI雙酶切使載體線性化，同理將反義片段連入表達載體。提取陽性克隆質粒以相應內切酶進行正義片段和反義片段的酶切驗證，鑒定正確的克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4表達載體導入根癌農桿菌將測序驗證正確的重組質粒轉入根癌農桿菌EHA105感受態(tài)細胞。取2 μg質粒DNA加入從-70℃超低溫冰箱取出的農桿菌感受態(tài)細胞，混勻后冰浴30 min；轉入液氮速凍1 min；加入1 ml YEP培養(yǎng)基（不含抗生素），30℃、120 r/min培養(yǎng)4 h；4 000 r/min離心1 min，棄上清；加150 μl YEP培養(yǎng)基（不含抗生素）重懸，將菌液涂布與含50 μg/ml Kan和10μg/ml Amp的YEP固體平板；28℃培養(yǎng)48 h至單菌落長出，進行菌落PCR鑒定。

2　結果與分析

2.1水稻中谷蛋白同源性分析

以谷蛋白基因Os10g0400200全長序列（1540bp）對水稻全基因組數據庫進行搜索比對，獲得16個谷蛋白基因信息（Os10g0400200、Os01g0762500、Os02g0249800、Os02g0249000、Os02g0249600、Os02g0268300、Os02g0268100、Os02g0248800、Os02g 0242600、Os02g 0453600、Os02g 0249000、Os03g 0427300、Os12g 0155200、Os08g 0127900、Os11g 0153400、Os05g0170300）。通過NCBI Blast軟件對這些基因進行全長比對，結果表明其同源性極高（圖1）。選取其中部分保守區(qū)域作為靶位點，序列為：tttgataggttgcaagcatttgagccaattcggagtgtgaggtctcaagctggcacaactgagttcttcgatgtctctaatgagttgtttcaatgtaccggagtatctgttgtccgccgagttattgaa。以該區(qū)域為靶序列可能同時抑制所有谷蛋白基因的表達。

圖1　水稻谷蛋白基因的同源性比對

2.2表達載體構建

回收PCR片段后連入T載體，分別酶切后與相應的酶線性化的載體進行連接，對所獲重組子進行正義片段和反義片段的酶切驗證。酶切結果顯示，所獲表達載體中含有129 bp的正義和反義片段（圖2）。測序結果表明，正義和反義片段已正確連入pCAMBIA1390 RNAi骨架載體。

M為genomic DNA marker II；1為正義片段酶切結果；2為反義片段酶切結果。圖2重組子正義和反義片段的雙酶切驗證

2.3重組子導入根癌農桿菌

提取測序正確克隆的質粒DNA轉化根癌農桿菌EHA105感受態(tài)細胞，液氮速凍和恢復培養(yǎng)后涂于含卡那霉素和利福平的YEP平板。培養(yǎng)2 d后獲得大量轉化克隆（圖3），菌落PCR表明重組質粒已導入根癌農桿菌菌株EHA105。

圖3　陽性農桿菌克隆

3　結論

谷蛋白是水稻種子中含量最高的儲藏蛋白，其含量占總蛋白的80%左右，包括至少12個編碼基因［3］。通過敲除或降低谷蛋白表達，對提高外源基因的表達水平很有意義和潛力。該研究通過水稻全基因組比對分析，獲得16個谷蛋白成員信息。序列比對獲得其保守區(qū)域，并選取其中129 bp構建RNAi干涉載體，雙酶切驗證和測序結果表明干涉載體構建成功。

參考文獻：

［1］OU J Q，GUO Z B，SHI J N，et al. Transgenic rice endosperm as a bioreactor for molecular pharming［J］. Plant Cell Reports，2014，33：585-594.

［2］YANG L，SUZUKI K，HIROSE S，et al. Development of transgenic rice seed accumulating a major Japanese cedar pollen allergen（Cry j1）structurally disrupted for oral immunotherapy［J］. Plant Biotechnol J.，2007，5：815-826.

［3］GREENHAM T，ALTOSAAR I. Molecular strategies to engineer transgenic rice seed compartments for large -scale production of plant -made pharmaceuticals［J］. Methods Mol. Biol.，2013，956：311-326.

［4］BENCHABANE M，GOULET C，RIVARD D，et al. Preventing unintended proteolysis in plant protein biofactories［J］. Plant Biotechnol J.，2008，6（7）：633-648.

［5］BOOTHE J，NYKIFORUK C，SHEN Y，et al. Seedbased expression systems for plant molecular farming ［J］. Plant Biotechnol J.，2010，（5）：588-606.

［6］SHIGEMITSU T，OZAKI S，SAITO Y，et al. Production of human growth hormone in transgenic rice seeds：co -introduction of RNA interference cassette for suppressing the gene expression of endogenous storage pro－teins［J］. Plant Cell Rep.，2012，31：539-549.

［7］TADA Y，UTSUMI S，TAKAIWA F. Foreign gene products can be enhanced by introduction into low storage protein mutants［J］. Plant Biotechnol J.，2003，1：411-422.

［8］KURODA M，KIMIZU M，MIKAMI C. A simple set of plasmids for the production of transgenic plants［J］. Biosci. Biotechnol. Biochem.，2010，74（11）：2 348-2 351.

［9］TOKUHARA D，YUKI Y，NOCHI T，et al. Secretory IgA-mediated protection against V. cholerae and heatlabile enterotoxin-producing enterotoxigenic Escherichia coli by rice-based vaccine［J］. PNAS，2010，107：8 794-8 799.

［10］KUROKAWA S，KURODA M，MEJIMA M，et al. RNAi-mediated suppression of endogenous storage proteins leads to a change in localization of overexpressed cholera toxin B-subunit and the allergen protein RAG2 in rice seeds［J］. Plant Cell Rep.，2014，33：75-87.

［11］MARUTA Y，UEKI J，SATO H，et al. Transgenic rice with reduced glutelin content by transformation with glutelin A antisense gene［J］. Mol. Breed，2001，8：273-284.

［12］KIM H J，LEE J Y，YOON U H，et al. Effects of reduced prolamin on seed storage protein composition and the nutritional quality of rice［J］. Int. J. Mol. Sci.，2013，14：17 073-17 084.

［13］KUSABA M，MIYAHARA K，IIDA S，et al. Low glutelin content1：A dominant mutation that suppresses the glutelin multigene family via RNA silencing in rice ［J］. Plant Cell，2003，15：1 455-1 467.

［14］KAWAKATSU T，HIROSE S，YASUDA H，et al. Reducing rice seed storage protein accumulation leads to changes in nutrient quality and storage organelle formation［J］. Plant Physiol.，2010，154：1 842-1 854.

（本文責編：金蘋）

通訊作者：薛建平（1966—），男，河南溫縣人，教授，博士，主要從事植物生物技術研究。E-mail：xuejp@163.com

作者簡介：趙豐蘭（1979—），女，安徽壽縣人，講師，碩士，主要從事植物生物技術研究。E-mail：zhaofenglan1997@163. com

基金項目：安徽省教育廳省級高校自然科學基金重點項目（KJ2014A226）

收稿日期：2015-07-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2015.09.011

中圖分類號：S511

文獻標識碼：A

文章編號：1001-1463（2015）09-0028-04