王杰，粟宏偉，劉鑫，龐宇，朱智，王春娟（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州646000）

鈣化性納米微粒致腎結(jié)石大鼠尿液中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、骨橋蛋白及單核細(xì)胞趨化蛋白-1的變化及其意義*

王杰，粟宏偉，劉鑫，龐宇，朱智，王春娟
（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州646000）

摘要：目的在建立鈣化性納米微粒（CNPs）致大鼠腎結(jié)石模型的過(guò)程中，檢測(cè)大鼠不同時(shí)間尿液中的中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）、骨橋蛋白（OPN）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）的含量，初步分析CNPs致腎結(jié)石的形成機(jī)制。方法利用腎結(jié)石患者術(shù)中所得結(jié)石培養(yǎng)出CNPs，制成CNPs混懸液。20只SD雄性大鼠隨機(jī)分為CNPs誘石組（A組）和空白對(duì)照組（B組）。通過(guò)鼠尾靜脈注射CNPs感染大鼠，分別于注射后4 h、12 h、24 h、1周、2周及8周用代謝籠收集大鼠尿液，酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）檢測(cè)大鼠各時(shí)間尿液中NGAL、OPN、MCP-1的含量。于注射CNPs后1、2和8周分批次處死大鼠，腎臟組織HE染色后于光鏡下觀察其結(jié)晶的形成及病理改變，對(duì)照分析結(jié)晶的形成與大鼠尿液中NGAL、OPN、MCP-1含量變化的關(guān)系。結(jié)果在注射CNPs后4 h，與B組比較，A組的NGAL水平顯著增高（P<0.05），2周時(shí)A組的OPN、MCP-1水平開始大幅度升高（P<0.05），8周時(shí)A組的NGAL、OPN、MCP-1的含量均明顯升高（P<0.05）。1周時(shí)，A組腎臟組織可見少量腎小管上皮細(xì)胞顆粒樣變性，腎小管內(nèi)未見鈣鹽晶體沉積；2周時(shí)，A組腎小管內(nèi)可見少量鈣鹽晶體沉積，伴有少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性和顆粒樣變性；2周后腎小管內(nèi)鈣鹽晶體的沉積量與NGAL、OPN、MCP-1的含量呈正相關(guān)；8周時(shí)，A組腎小管內(nèi)可見大量鈣鹽晶體沉積，伴有廣泛腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性，腎小管上皮細(xì)胞的病理改變程度與NGAL的含量呈正相關(guān)；B組腎臟組織未見鈣鹽沉積和病理改變。結(jié)論大鼠感染CNPs 4 h后即腎小管上皮細(xì)胞開始受到損傷，并且損傷程度與NGAL水平呈正相關(guān)。2周后腎小管內(nèi)開始出現(xiàn)鈣鹽晶體的黏附和聚集，單核-巨噬細(xì)胞和OPN參與其黏附和聚集過(guò)程，并且鈣鹽晶體的沉積量隨損傷程度加重也相應(yīng)增加。

關(guān)鍵詞：腎結(jié)石；鈣化性納米微粒；中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白；骨橋蛋白；單核細(xì)胞趨化蛋白-1

近年來(lái)，中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）作為一種早期腎損傷的敏感標(biāo)志物，在腎損傷相關(guān)疾病中有重要的研究?jī)r(jià)值。骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoat tractant protein-1，MCP-1）的表達(dá)與腎小管上皮細(xì)胞和鈣鹽晶體有密切的關(guān)系，從而成為腎結(jié)石形成機(jī)制相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本研究在建立鈣化性納米微粒（calcifying nanoparticles，CNPs）致大鼠腎結(jié)石模型的過(guò)程中，通過(guò)監(jiān)測(cè)腎結(jié)石形成過(guò)程中的NGAL、OPN、MCP-1水平變化，對(duì)CNPs致腎結(jié)石形成機(jī)制進(jìn)行初步分析。

1　材料與方法

1.1CNPs致大鼠腎結(jié)石模型的建立

1.1.1CNPs混懸液的制備術(shù)中無(wú)菌收集經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)患者的結(jié)石標(biāo)本，去礦物質(zhì)、中和、洗滌、研磨、濾器過(guò)濾、離心取管底液，10%（體積分?jǐn)?shù)）熱滅活γ-FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%二氧化碳CO2和95%氧O2條件下培養(yǎng)6～8周，換液30 d/次。倒置相差顯微鏡下形態(tài)學(xué)鑒定和Von Kossa染色鑒定，篩選出無(wú)污染的標(biāo)本并制成CNPs混懸液。

1.1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組20只3月齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，每組10只：CNPs誘石組（A組）、空白對(duì)照組（B組）。兩組大鼠先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。通過(guò)鼠尾靜脈注射CNPs感染大鼠。

1.2實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集

分別于注射CNPs后4 h、12 h、24 h、1周、2周及8周代謝籠收集大鼠尿液，將收集的尿液3 000 r/min離心后及時(shí)密封置于-80℃的冰箱保存。于注射CNPs后1、2和8周分批次處死大鼠，切取腎臟，縱向剖開，10%（體積分?jǐn)?shù)）中性甲醛溶液固定，空氣注射處死大鼠。

1.3觀察指標(biāo)

對(duì)腎臟組織進(jìn)行石蠟包埋、切片，HE染色后于普通光鏡下觀察結(jié)晶的形成及病理改變。利用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）測(cè)定大鼠不同時(shí)間尿液中NGAL、OPN、MCP-1的含量，對(duì)照分析結(jié)晶的形成與大鼠尿液中NGAL、OPN、MCP-1含量變化的關(guān)系。

1.4酶聯(lián)免疫分析法

①用純化的大鼠NGAL抗體包被96T微孔板，制成固相抗體；②在酶標(biāo)包被板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔10個(gè)（復(fù)孔），加入純化標(biāo)準(zhǔn)NGAL，按照50%的濃度梯度進(jìn)行稀釋；③分別設(shè)空白孔（空白孔不加樣品及酶標(biāo)試劑）、待測(cè)樣品孔，在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測(cè)樣品10μl，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不要觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)均勻；④用封板膜封板后置于37℃溫育30 min；⑤小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；⑥每孔加入HRP酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外；⑦用封板膜封板后置于37℃溫育30 min，然后用洗滌液再次按上述方法重復(fù)洗滌5次；⑧每孔加入TMB顯色劑50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；⑨每孔加終止液50μl終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變成黃色；⑩以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值），測(cè)定在加終止液后15 min內(nèi)進(jìn)行；以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)換算出樣品實(shí)際濃度。以同樣的方法測(cè)定不同時(shí)間段大鼠尿液中OPN、MCP-1的含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不同時(shí)間段的計(jì)量資料數(shù)據(jù)的組間分析用重復(fù)測(cè)量的方差分析，相同時(shí)間段的組間比較用One-way ANOVA方差分析，兩組比較用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠不同時(shí)間段尿液的NGAL水平

與注射CNPs 4 h后大鼠尿液中NGAL水平相比，A組中NGAL水平變化隨時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)（P<0.05）。在One-way ANOVA方差分析結(jié)果中，與B組比較，A組注射CNPs后4 h的NGAL水平即開始顯著增高（P<0.05），A組在其他時(shí)間段內(nèi)的NGAL水平也有不同程度的提高（P<0.05）。見表1。

2.2大鼠不同時(shí)間段尿液的OPN水平

與注射CNPs后4 h大鼠尿液中OPN水平比較，2周前A組大鼠尿液中OPN水平呈緩慢升高狀態(tài)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），2周后A組大鼠尿液中OPN水平開始大幅度升高，8周時(shí)OPN水平升至最高（P<0.05）。在One-way ANOVA方差分析結(jié)果中，與B組比較，A組在注射CNPs后2和8周內(nèi)OPN水平顯著升高（P<0.05）。見表2。

表1　大鼠不同時(shí)間段尿液中NGAL水平比較（n=10，±s，ng/L）

表1　大鼠不同時(shí)間段尿液中NGAL水平比較（n=10，±s，ng/L）

注：與注射CNPs后4 h比較，P<0.05

組別　4 h　12 h　24 h　1周　2周　8周A 1 913.46±223.23　2 934.91±438.62　2 444.33±593.56　3 471.10±294.55　3 786.23±161.13　3 978.85±810.81　B 1 583.54±57.49　1 676.12±170.22　1 463.59±236.01　1 511.06±221.93　1 473.50±119.25　1 642.58±109.75 P值　0.135　0.038　0.043　0.031　0.029　0.020

表2　大鼠不同時(shí)間段尿液中OPN水平比較（n=10±s，μg/L）

表2　大鼠不同時(shí)間段尿液中OPN水平比較（n=10±s，μg/L）

注：與注射CNPs后4 h比較，P<0.05

組別　4 h　12 h　24 h　1周　2周　8周A 18.99±2.22　19.40±6.67　21.86±4.98　22.90±3.53　28.00±2.69　33.35±10.93　B 15.59±2.30　16.79±3.14　14.44±3.69　17.18±4.67　16.40±1.54　18.56±2.93 P值　0.253　0.294　0.131　0.065　0.030　0.027

表3　大鼠不同時(shí)間段尿液中MCP-1水平比較（n=10±s，μg/L）

表3　大鼠不同時(shí)間段尿液中MCP-1水平比較（n=10±s，μg/L）

注：與注射CNPs后4 h比較，P<0.05

組別　4 h　12 h　24 h　1周　2周　8周A 457.70±3.50　458.24±53.33　552.94±64.00　555.64±138.26　573.78±50.22　734.07±201.47　B 437.07±6.82　474.68±25.23　515.39±90.27　535.44±84.53　525.92±29.95　534.81±51.14 P值　0.199　0.298　0.125　0.193　0.022　0.007

2.3大鼠不同時(shí)間段尿液的MCP-1水平

與注射CNPs后4 h大鼠尿液中MCP-1水平比較，2周后A組的MCP-1水平開始大幅度升高，8周時(shí)MCP-1水平升至最高（P <0.05）。在One-wayANOVA方差分析結(jié)果中，與B組比較，在注射CNPs 后2和8周內(nèi)A組的MCP-1水平顯著升高（P < 0.05）。見表3。

2.4不同時(shí)間段大鼠腎臟的鏡檢結(jié)果及其與NGAL、OPN、MCP-1含量的關(guān)系

1周時(shí)，A組腎臟組織HE染色后未見晶體沉積，可見少量腎小管上皮細(xì)胞顆粒樣變性（見圖1）。2周時(shí)，A組腎臟組織HE染色后可見腎小管內(nèi)少量晶體沉積，伴有少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性和顆粒樣變性（見圖2）。8周時(shí)，A組腎臟組織HE染色后可見腎小管內(nèi)大量晶體沉積，伴有廣泛腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變性（見圖3）。B組腎臟組織未見鈣鹽沉積和病理改變。隨腎小管上皮細(xì)胞損傷的加重，A組大鼠尿液中NGAL水平也不斷升高，可見腎小管上皮細(xì)胞的損傷程度與NGAL水平呈正相關(guān)。腎小管內(nèi)鈣鹽晶體的沉積量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增多（見表4），2周后腎小管內(nèi)鈣鹽晶體的沉積量與NGAL、OPN、MCP-1水平呈正相關(guān)。

圖1　注射CNPs 1周后A組大鼠腎臟組織切片（HE染色×200）

圖2　注射CNPs 2周后A組大鼠腎臟組織切片（HE染色×400）

圖3　注射CNPs 8周后A組大鼠腎臟組織切片（HE染色×200）

表4　A組大鼠不同時(shí)間段腎小管內(nèi)鈣鹽結(jié)晶沉積量（n=10）

3　討論

CNPs是一類能夠自我復(fù)制的納米級(jí)蛋白復(fù)合體，具有自我礦化的特性，與許多病理鈣化性疾病都有密切聯(lián)系。有實(shí)驗(yàn)研究已成功從腎結(jié)石患者的血液、尿液、結(jié)石中分離和培養(yǎng)出CNPs[1]。GARCIA 等[2]將培養(yǎng)出的CNPs直接經(jīng)皮向腎內(nèi)注射，成功建立CNPs致腎結(jié)石大鼠的動(dòng)物模型。CNPs可能作為腎結(jié)石形成過(guò)程的礦化中心這一假說(shuō)開始受到研究人員的廣泛關(guān)注，也為闡明腎結(jié)石的形成機(jī)制提供新的探索思路。

有文獻(xiàn)報(bào)道，受損的腎小管上皮細(xì)胞能分泌和產(chǎn)生多種先天性和獲得性免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)生物物質(zhì)，其中包括NGAL[3-4]。NGAL是一種相對(duì)分子量為25 kD的蛋白，屬于Lipocalin的家族成員之一。其最開始是在活化的中性粒細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)在包括腎小管上皮細(xì)胞在內(nèi)的其他類型細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有NGAL的表達(dá)[5]。NGAL作為腎損傷的早期敏感標(biāo)志物之一，現(xiàn)已成為腎臟損傷相關(guān)疾病的研究焦點(diǎn)。通常在發(fā)生腎損傷幾天后，腎臟功能喪失近一半時(shí)，血肌酐水平才會(huì)明顯升高[6-7]。而相關(guān)文獻(xiàn)表明，在出現(xiàn)急性腎損傷早期，血肌酐升還未升高時(shí)，即可測(cè)得患者血清NGAL水平明顯升高[8]。有學(xué)者在人類和嚙齒類動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在出現(xiàn)腎小管損傷時(shí)體內(nèi)NGAL表達(dá)量增加1 000倍，早期即可在血清和尿液中檢測(cè)到[9]。于澄釩等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CNPs能損傷腎小管上皮細(xì)胞，CNPs作用HK-2細(xì)胞6 h后脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛含量即開始增加，12 h后細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性等病理性改變。本實(shí)驗(yàn)注射CNPs后4 h，A組（CNPs誘石組）大鼠尿液中的NGAL水平相比B組（空白對(duì)照組）即開始升高，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而不斷升高。2周后A組大鼠腎臟病理檢查結(jié)果顯示，少數(shù)腎小管內(nèi)可見鈣鹽晶體沉積，腎小管上皮細(xì)胞可見少量空泡樣變性和顆粒樣變性。在8周時(shí)NGAL水平達(dá)到最高，A組大鼠腎臟病理檢查結(jié)果顯示，腎小管上皮細(xì)胞可見廣泛空泡樣變性，腎小管內(nèi)可見大量鈣鹽晶體沉積；B組未見鈣鹽晶體沉積和病理改變?？梢娔I小管上皮細(xì)胞的病理改變程度與NGAL水平呈正相關(guān)，2周后腎小管內(nèi)鈣鹽晶體沉積量隨NGAL水平的升高而增加。這些大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次證實(shí)CNPs對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用，并且損傷過(guò)程伴有NGAL表達(dá)水平的升高。

OPN是一種分子量為32 kD的磷酸化糖蛋白，最早在骨組織中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)在動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞、膽囊、腎臟等其他組織和器官的鈣化部位也發(fā)現(xiàn)有OPN的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在腎結(jié)石大鼠的腎臟內(nèi)OPN表達(dá)水平明顯升高[11]。LIESKE等[12]通過(guò)猴腎小管上皮細(xì)胞和草酸鈣晶體共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)OPN的基因表達(dá)明顯增強(qiáng)。OPN與腎結(jié)石形成機(jī)制存在的密切關(guān)系使其成為廣大學(xué)者的研究焦點(diǎn)。于澄釩等[10]發(fā)現(xiàn)當(dāng)CNPs損傷腎小管上皮細(xì)胞后，細(xì)胞的晶體黏附能力明顯增強(qiáng)。當(dāng)OPN作為一種溶解狀態(tài)的大分子物質(zhì)存在于尿液中時(shí)，能夠抑制草酸鈣的成核，減弱其黏附力[13-14]。本實(shí)驗(yàn)在注射CNPs后的2周內(nèi)，A組大鼠尿液的OPN水平升高不明顯，腎小管內(nèi)未見鈣鹽晶體的沉積。2周后，A組大鼠尿液的OPN水平開始出現(xiàn)大幅度升高，腎小管上皮細(xì)胞周圍也開始出現(xiàn)鈣鹽晶體的黏附和聚集，隨時(shí)間延長(zhǎng)，腎小管內(nèi)晶體沉積量也相應(yīng)增加。由此提出猜想，鈣鹽晶體對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的黏附作用刺激其表達(dá)OPN，生成的OPN通過(guò)與受損的腎小管上皮細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)及與鈣鹽晶體的結(jié)合，從而削弱其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的黏附力，抑制鈣鹽晶體的成核。然而KONYA 等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，表面固化的OPN能夠增強(qiáng)草酸鈣的黏附性，促進(jìn)結(jié)石的形成。由此提出假設(shè)，OPN與鈣鹽晶體結(jié)合以后形成的復(fù)合晶體可能對(duì)腎小管形成新的堵塞，再加上腎小管上皮細(xì)胞的進(jìn)行性損傷，新形成的復(fù)合晶體無(wú)法從腎小管內(nèi)排出，于是在管內(nèi)堆砌、聚集，促進(jìn)結(jié)石的形成。同時(shí)，增多的鈣鹽晶體刺激腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)更多的OPN。可見不同蛋白構(gòu)型的OPN對(duì)腎結(jié)石的形成過(guò)程可能起不同的作用。

MCP-1是屬于CC趨化因子亞科的成員之一，其主要作用是發(fā)生局部炎癥反應(yīng)時(shí)趨化單核細(xì)胞和氧自由基進(jìn)入炎癥組織[16]。在正常的腎小管上皮細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)都有微量的表達(dá)。當(dāng)上述細(xì)胞受損時(shí)，MCP-1的表達(dá)水平升高[17-18]。增多的MCP-1可以趨化單核-巨噬細(xì)胞進(jìn)入腎臟炎癥組織，通過(guò)釋放更多的炎癥因子來(lái)進(jìn)一步損傷腎小管上皮細(xì)胞。在腎結(jié)石動(dòng)物模型的研究中也有發(fā)現(xiàn)，鈣鹽晶體周圍有單核-巨噬細(xì)胞的包繞[19]。UMEKAWA[20]等在研究中發(fā)現(xiàn)，將草酸鈣和磷酸鈣晶體暴露于腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中時(shí)，能夠刺激腎小管上皮細(xì)胞增加MCP-1的表達(dá)量，且自由基參與此增量調(diào)節(jié)過(guò)程。HABIBZADEGAH-TARI等[21]也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，草酸鈣晶體能夠促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞合成和分泌MCP-1，其產(chǎn)生過(guò)程由活性氧自由基介導(dǎo)調(diào)節(jié)，并且使用抗氧化劑能抑制鈣鹽沉積。本實(shí)驗(yàn)注射CNPs 2周內(nèi)A組大鼠尿液的MCP-1水平并無(wú)明顯升高；2周后鈣鹽晶體開始聚集、黏附腎小管上皮細(xì)胞，A組大鼠尿液的MCP-1水平出現(xiàn)大幅度升高；8周后腎小管內(nèi)出現(xiàn)大量鈣鹽晶體沉積，A組大鼠尿液的MCP-1水平升至最高。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)鈣鹽晶體能夠刺激和促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生MCP-1，且不斷增多的鈣鹽晶體能刺激腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)更多的MCP-1。HABIBZADEGAH-TARI[21]在其研究結(jié)果中還提到使用抗氧化劑能夠有效抑制鈣鹽的沉積，這可能為尋找有效治療和預(yù)防腎結(jié)石的方法提供新的探索方向。

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（申海菊編輯）

Changes in urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin, osteopontin and monocyte chemoattractant protein-1 in rats with renal calculi induced by calcified
nanoparticles and their significance*

Jie WANG, Hong-wei SU, Xing LIU, Yu PANG, Zhi ZHU, Chun-juan WANG
(Department of Urology, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou, Sichuan 646000, P.R. China)

Abstract:【Objective】To detect the content of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), osteopontin (OPN) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in rat urine in different periods during the process of establishment of renal calculus rat model induced by calcified nanoparticles (CNPs) so as to analyzebook=2,ebook=8the mechanism of kidney stone formation induced by CNPs.【Methods】Calcified nanoparticles were extracted and cultivated from clinically diagnosed patients with nephrolithiasis. Twenty adult male SD rats were randomized into 2 groups (10 in each group): group A was given an intravenous injection of calcified nanoparticles while group B was used as normal control. Urine of rats was collected by using metabolic cages in different periods after injection of CNPs. The content of NGAL, OPN and MCP-1 in rat urine was detected using ELISA. Rats were sacrificed in different periods. The kidneys were examined for pathology.【Results】In the group A, NGAL began to increase 4 hours after injection of CNPs (P < 0.05); OPN and MCP-1 began to largely increase 2 weeks after injection of CNPs (P< 0.05); NGAL, OPN and MCP-1 rose more significantly 8 weeks after injection of CNPs (P< 0.05) compared to those in the group B. At the 1st week, histopathological studies of the renal tissue of the group A showed granular degeneration of a small amount of renal tubular epithelial cells without renal tubular crystallization. At the 2nd week, histopathological studies revealed small quantities of calcium crystals in the renal tubules accompanied with vacuolar degeneration and granular degeneration of a few renal tubular epithelial cells. After 2 weeks, the deposition of calcium crystals in the renal tubules was positively related to the levels of NGAL, OPN and MCP-1. At the 8th week, histopathological changes included a large number of calcium crystals in the renal tubules and extensive vacuolar degeneration of renal tubular epithelial cells which were positively correlated to the content of NGAL. No calcium crystal deposition or pathological changes could be seen in the renal tissue of group B.【Conclusions】Calcified nanoparticles begin to injure renal tubular epithelial cells 4 hours after injection of CNPs, and NGAL level is positively correlated with the degree of injury. The adhesion and aggregation of calcium crystals begin to appear in the renal tubules 2 weeks after injection of CNPs, and the crystals increase with the increased severity of renal tubular injury. Mononuclear macrophage and OPN are involved in the adhesion and aggregation process.

Key words:renal calculus; calcified nanoparticle; neutrophil gelatinase-associated lipocalin; osteopontin; monocyte chemoattractant protein-1

［通信作者］粟宏偉；E-mail：ximi47325@163.com

*基金項(xiàng)目：四川省科技廳資助項(xiàng)目（No：14JC0105）；四川省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目（No：100288）

收稿日期：2015-04-14

文章編號(hào)：1005-8982（2015）23-0001-06

中圖分類號(hào)：R692.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A