謝海峰，張宏波，喬慶東，馬小芳，孟翔宇（.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院泌尿外一科，河南新鄉(xiāng)45000；.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，河南鄭州45000；.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)腫瘤學(xué)教研室，河南鄭州45000）

RNA干擾沉默F(xiàn)ra-1基因?qū)Π螂装㏕24細(xì)胞侵襲和遷移的影響

謝海峰1，張宏波2，喬慶東1，馬小芳3，孟翔宇2
（1.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院泌尿外一科，河南新鄉(xiāng)453000；2.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，河南鄭州450001；3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)腫瘤學(xué)教研室，河南鄭州450001）

摘要：目的研究RNA干擾沉默F(xiàn)ra-1基因表達(dá)對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。方法設(shè)計(jì)合成Fra-1特異性siRNA并轉(zhuǎn)染人膀胱癌T24細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（轉(zhuǎn)染時(shí)只加脂質(zhì)體）、陰性對(duì)照組（無(wú)關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染）和干擾組（Fra-1特異siRNA轉(zhuǎn)染）。采用RT-PCR檢測(cè)Fra-1、MMP-2及MMP-9 mRNA水平。Western blot檢測(cè)Fra-1、MMP-2、MMP-9、STAT3及磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表達(dá)水平，Transwell小室法和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力。結(jié)果干擾組T24細(xì)胞Fra-1、MMP-2及MMP-9 mRNA水平較其他兩組明顯降低（P<0.01），并且其MMP-2、MMP-9及p-STAT3蛋白表達(dá)受到明顯抑制（P< 0.01）。干擾組T24細(xì)胞侵襲力和遷移力較其他兩組明顯下降（P<0.01）。結(jié)論RNA干擾可有效抑制T24細(xì)胞中Fra-1基因的表達(dá)，降低細(xì)胞侵襲及遷移能力，其機(jī)制可能與STAT3/MMPs信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：膀胱腫瘤；RNA干擾；轉(zhuǎn)染；Fra-1；STAT3；MMPs

Fra-1基因定位于染色體11q13，編碼長(zhǎng)度為1.7 kb的成熟mRNA，其表達(dá)產(chǎn)物Fra-1蛋白由271個(gè)氨基酸組成，作為核轉(zhuǎn)錄因子AP-1家族中Fos亞家族的成員之一，其可通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域與Jun蛋白形成異源二聚體，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡[1]。Fra-1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移[1-3]。本研究中，筆者采用RNA干擾技術(shù)抑制膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞中Fra-1基因的表達(dá)，觀察對(duì)T24細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響并探討其分子機(jī)制，為以Fra-1為靶點(diǎn)的膀胱癌基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑

人膀胱移行細(xì)胞癌T24細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，RT-PCR試劑盒為大連TaKaRa生物公司產(chǎn)品，兔抗人Fra-1、MMP-2、MMP-9及β-actin多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，鼠抗人STAT3，p-STAT3及Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，Transwell小室購(gòu)自Costar公司；Lipofectin2000購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2Fra-1 siRNA設(shè)計(jì)及制備

根據(jù)人Fra-1基因（NM_005438.3）設(shè)計(jì)序列：正向引物5'-GUUCCGAGCGGACGGGUCCUU-3'，反向引物3'-GGACCCGUCCGCUCGGAACUU-5'。siRNA序列均由廣州銳博公司合成并純化。為了避免可能偏靶，采用嚴(yán)格BALST進(jìn)行比對(duì)，GenBank中證實(shí)Fra-1 siRNA僅與Fra-1基因存在相應(yīng)的匹配位點(diǎn)，無(wú)關(guān)序列dsRNA與任何已知哺乳動(dòng)物基因無(wú)匹配。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染

采用無(wú)抗生素、含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳CO2條件下培養(yǎng)T24細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度，接種至6孔板，每孔約1×106個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分成3組，空白對(duì)照組（轉(zhuǎn)染時(shí)只加脂質(zhì)體）、陰性對(duì)照組（無(wú)關(guān)序列siRNA轉(zhuǎn)染）和干擾組（Fra-1特異siRNA轉(zhuǎn)染）。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，采用脂質(zhì)體Lipofe-ctamine 2000轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4轉(zhuǎn)染效率觀察

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用480 nm波長(zhǎng)藍(lán)光激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，判斷轉(zhuǎn)染效率。

1.5RT-PCR檢測(cè)Fra-1、MMP-2及MMP-9 mRNA水平

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2、3次，按Trizol說明書操作提取細(xì)胞總RNA，取2μg總RNA用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以2μl的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，β-actin為內(nèi)參照。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（見附表）。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸10 s，總共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延長(zhǎng)5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外線透射觀察儀觀察并照相。

附表RT-PCR引物序列

1.6Western blot檢測(cè)Fra-1、MMP-2，MMP-9、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，使用預(yù)冷的裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，按說明書操作提取蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE（8%分離膠，5%濃縮膠）電泳后，蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉，分別加入稀釋的一抗37℃孵育2 h，TBST洗膜后，加入相應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜。化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)液與膜充分接觸，暗室曝光顯影，沖洗膠片，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。

1.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

用50 mg/L Matrigel（1∶8）稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干，37℃水化30 min，取轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞，用100μl含0.1%BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)細(xì)胞/ml并將懸液加入Transwell小室，下室加入600μl完全培養(yǎng)基作為趨化劑，培養(yǎng)24 h。取出上室，用棉簽擦去上室中未侵襲細(xì)胞，PBS浸洗1遍。10%甲醇固定30 s，PBS連續(xù)洗3遍。用0.2%結(jié)晶紫染色10 min，用棉簽擦去多余結(jié)晶紫，PBS再洗3遍。光鏡下觀察濾膜下表面的細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野的細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

1.8劃痕實(shí)驗(yàn)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔密度接種于6孔培養(yǎng)板。24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，步驟同1.3。轉(zhuǎn)染6 h后，用無(wú)菌Tip頭（規(guī)格200μl）在單層細(xì)胞上做“1”字形劃痕，寬度和長(zhǎng)度在1 mm×20 mm左右，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用無(wú)血清培養(yǎng)基輕輕吹打劃痕附近，吸去培養(yǎng)基，反復(fù)3次，盡量將刮掉的細(xì)胞沖洗干凈。加入不含雙抗無(wú)FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，于24和48 h觀察并拍照，顯微鏡下計(jì)數(shù)單位面積劃痕區(qū)內(nèi)遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡下觀察，陰性對(duì)照組和干擾組90%以上細(xì)胞可見綠色熒光（見圖1）。

2.2siRNA對(duì)T24細(xì)胞Fra-1、MMP-2及MMP-9 mRNA水平的影響

由圖2顯示，F(xiàn)ra-1 siRNA轉(zhuǎn)染可有效抑制T24細(xì)胞Fra-1、MMP-2及MMP-9 mRNA的表達(dá)，其抑制率分別為51.5%、47.3%和35.6%（P<0.01）。陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。

2.3siRNA對(duì)T24細(xì)胞Fra-1、MMP-2、MMP-9、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

由圖3顯示，與空白對(duì)照組比較，干擾組細(xì)胞Fra-1、MMP-2、MMP-9及p-STAT3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01），其下調(diào)量分別為65.4%、53.7%、47.0%和81.0%，而總STAT3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05）?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4siRNA對(duì)T24細(xì)胞體外侵襲和遷移能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及干擾組中穿透Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)分別為（505.7±51.6）、（496.5±49.7）和（307.5±47.1）。干擾組細(xì)胞侵襲能力較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組分別減少39.2%（P<0.01）和38.1%（P<0.01），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，劃痕處理24 h后，空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及干擾組中遷移細(xì)胞數(shù)分別為（32.7±0.3）、（31.5±0.5）和18.3±0.6）。劃痕處理48 h后，以上3組中遷移細(xì)胞數(shù)分別為（53.6±1.8），（51.3±2.1）和（29.5±1.5）。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，干擾組分別與其他兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

圖1　T24細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡觀察結(jié)果

圖2　RT-PCR檢測(cè)T24細(xì)胞Fra-1、MMP-2 和MMP-9 mRNA水平

圖3　Western blot檢測(cè)T24細(xì)胞Fra-1、MMP-2、MMP-9、STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)

圖4　Transwell小室法檢測(cè)T24細(xì)胞的侵襲能力

圖5　劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)T24細(xì)胞的遷移能力

3　討論

膀胱癌是我國(guó)最常見的泌尿系腫瘤，占全部惡性腫瘤的3.2%，具有惡性程度高、浸潤(rùn)發(fā)展、易轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，其中侵襲和轉(zhuǎn)移是臨床上導(dǎo)致膀胱癌治療失敗的主要原因。本實(shí)驗(yàn)以T24細(xì)胞為研究對(duì)象，該細(xì)胞株來源于轉(zhuǎn)移性人膀胱移行細(xì)胞癌，適合膀胱癌的侵襲轉(zhuǎn)移研究。

Fra-1在腫瘤組織的高表達(dá)與腫瘤的侵襲能力密切相關(guān)。DESMET等[3]發(fā)現(xiàn)RNA干擾Fra-1后乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)侵襲能力顯著降低，認(rèn)為Fra-1與腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，可作為乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)。SAYAN等[4]亦發(fā)現(xiàn)80%侵襲性膀胱癌中Fra-1呈高表達(dá)，F(xiàn)ra-1可通過直接上調(diào)受體酪氨酸激酶AXL影響膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)中，筆者亦證實(shí)膀胱癌T24細(xì)胞表達(dá)Fra-1，siRNA轉(zhuǎn)染后Fra-1 mRNA水平及蛋白表達(dá)量均明顯下調(diào)，并且細(xì)胞的遷移及侵襲能力顯著減弱。

MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶類（matrix metallopmteinase，MMP）家族中的重要成員，能夠降解Ⅳ型、Ⅴ、Ⅵ及Ⅹ型膠原等多種細(xì)胞外基質(zhì)成分[5]。臨床研究表明[6]，膀胱癌的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后與MMP-2及MMP-9異常高表達(dá)密切相關(guān)。ADISESHAIAH等[7]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-1可通過誘導(dǎo)MMP-1、MMP-9活性及EGFR信號(hào)途徑活化增強(qiáng)肺癌上皮細(xì)胞的侵襲能力。KIMURA等[8]亦發(fā)現(xiàn)骨肉瘤143B細(xì)胞中MMP-1的基因表達(dá)依賴于Fra-1激活。SCHR魻ER等[9]發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞中，STAT3可通過間接誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1而上調(diào)MMP-9的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，通過RNA干擾下調(diào)T24細(xì)胞Fra-1基因表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞MMP-2及MMP-9 mRNA水平和蛋白表達(dá)量均明顯下調(diào)，說明RNA干擾下調(diào)Fra-1表達(dá)可影響侵襲相關(guān)基因MMP-2及MMP-9表達(dá)，從而抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力。

細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子與相應(yīng)的受體結(jié)合后可募集JAKs催化受體的酪氨酸殘基磷酸化并活化STAT3，使之轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)與特定DNA序列結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[10]。已有研究表明[11-12]，STAT3信號(hào)通路可在增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成及抗凋亡等多方面參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。ZUGOWSKI等[13]發(fā)現(xiàn)AP-1可激活Stat3，上調(diào)其下游基因MMP-1表達(dá)，增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力。此外，LUO等[14]還發(fā)現(xiàn)Fra-1可活化乳腺癌細(xì)胞Stat3信號(hào)途徑，上調(diào)MMP9、VEGF及TGF-β表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾組中p-STAT3蛋白表達(dá)下調(diào)81%，說明RNA干擾可明顯抑制T24細(xì)胞中STAT3磷酸化，從而阻斷STAT3活化，有效地調(diào)控其下游的侵襲相關(guān)基因MMP-2及MMP-9的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)研究初步證實(shí)RNA干擾沉默F(xiàn)ra-1基因可有效抑制T24細(xì)胞中Fra-1基因表達(dá)，降低T24細(xì)胞的侵襲及遷移能力，其分子機(jī)制可能與STAT3/ MMPs信號(hào)通路有關(guān)，提示Fra-1可作為膀胱腫瘤基因治療的理想靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] YOUNG MR, COLBURN NH. Fra-1 a target for cancer prevention or intervention[J]. Gene, 2006, 379: 1-11.

[2] USUI A, HOSHINO I, AKUTSU Y, et al. The molecular role of Fra-1 and its prognostic significance in human esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer, 2012, 118(13): 3387-3396.

[3] DESMET CJ, GALLENNE T, PRIEUR A, et al. Identification of a pharmacologically tractable Fra-1/ADORA2B axis promoting breast cancer metastasis [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110 (13): 5139-5144.

[4] SAYAN AE, STANFORD R, VICKERY R, et al. Fra-1 controls motility of bladder cancer cells via transcriptional upregulation of the receptor tyrosine kinase AXL [J]. Oncogene, 2012, 31 (12): 1493-1503.

[5]SHUMANMOSSLA,JENSEN-TAUBMANS, STETLER-STEVE-NSON WG. Matrix metalloproteinases: changing roles in tumor progression and metastasis[J]. Am J Pathol, 2012, 181(6): 1895-1899.

[6] OFFERSEN BV, KNAP MM, HORSMAN MR, et al. Matrix metalloproteinase-9 measured in urine from bladder cancer patients is an independent prognostic marker of poor survival [J]. Acta Oncol, 2010, 49(8): 1283-1287.

[7] ADISESHAIAH P, VAZ M, MACHIREDDY N, et al. A Fra-1-dependent, matrix metalloproteinase driven EGFR activation promotes human lung epithelial cell motility and invasion[J]. J Cell Physiol, 2008, 216(2): 405-412.

[8] KIMURA R, ISHIKAWA C, ROKKAKU T, et al. Phosphorylated c-Jun and Fra-1 induce matrix metalloproteinase-1 and thereby regulate invasion activity of 143B osteosarcoma cells[J]. Biochim Biophys Acta, 2011, 1813(8): 1543-1553.

[9] SCHR魻ER N, PAHNE J, WALCH B, et al. Molecular pathobiology of human cervical high-grade lesions: paracrine STAT3 activation in tumor-instructed myeloid cells drives local MMP-9 expression[J]. Cancer Res, 2011, 71(1): 87-97.

[10] JOHNSTON PA, GRANDIS JR. STAT3 signaling: anticancer strategies and challenges[J]. Mol Interv, 2011, 11(1): 18-26.

[11] WANG XH, LIU BR, QU B, et al. Silencing STAT3 may inhibit cell growth through regulating signaling pathway, telomerase, cell cycle, apoptosis and angiogenesis in hepatocellular carcinoma: potential uses for gene therapy[J]. Neoplasma, 2011, 58(2): 158-171.

[12] ERNST M, PUTOCZKI TL. Stat3: linking inflammation to (gastrointestinal) tumourigenesis [J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2012, 39(8): 711-718.

[13] ZUGOWSKI C, LIEDER F, M譈LLER A, et al. STAT3 controls matrix metalloproteinase-1 expression in colon carcinoma cells by both direct and AP-1-mediated interaction with the MMP-1 promoter[J]. Biol Chem, 2011, 392 (5): 449-459.

[14] LUO YP, ZHOU H, KRUEGER J, et al. The role of proto-oncogene Fra-1 in remodeling the tumor microenvironment in support of breast tumor cell invasion and progression[J]. Oncogene, 2010, 29(5): 662-673.

（申海菊編輯）

Effects of Fra-1 gene silencing by small interfering RNA on invasion and metastasis of bladder cancer T24 cells

Hai-feng XIE1, Hong-bo ZHANG2, Qing-dong QIAO1, Xiao-fang MA3, Xiang-yu MENG2(1. Department of Urology, Xinxiang Central Hospital, Xinxiang, Henan 453000, P.R. China; 2. Department of Anatomy, 3. Department of Basic Oncology, School of Basic
Medicine, Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450001, P.R. China)

Abstract:【Objective】To investigate the effects of Fra-1 gene silencing by small interfering RNA (siRNA) on invasion and migration of bladder cancer T24 cells in vitro.【Methods】The Fra-1 siRNA was constructed and then transfected into T24 cells in vitro. The blank control group, negative control group and siRNA transfection group were designed in this study. The expression level of Fra-1, MMP-2 and MMP-9 mRNAs were detected by RT-PCR. The expressions of Fra-1, MMP-2, MMP-9, total STAT3 and p-STAT3 proteins were detected by Western blot. The invasion and migration capabilities were evaluated by using Transwell chamber migration assay and scratch wound healing assay, respectively.【Results】The levels of Fra-1 mRNA, MMP-2 and MMP-9 mRNAs in the siRNA transfection group were significantly decreased compared with that in other groups (P< 0.01), so were the expressions of MMP-2, MMP-9 and p-STAT3 proteins (P< 0.01). In the siRNA transfection group, the invasion and migration capabilities of T24 cells were also significantly decreased compared with those in other groups (P< 0.01).【Conclusions】Small interfering RNA can efficiently inhibit the expression of Fra-1, which results in decreased capacities of invasion and migration of T24 cells. The mechanism may be involved in STAT3/MMPs signaling pathway.

Key words:bladder tumor; small interfering RNA; transfection; Fra-1; STAT3; matrix metalloproteinase

[通信作者]張宏波，E-mail：zhanghb@zzu.edu.cn

收稿日期：2014-11-28

文章編號(hào)：1005-8982（2015）23-0023-05

中圖分類號(hào)：R737.14

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A