程玉文，孫珮雯，朱晨潔，董濤，張國興（蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院生理學系，江蘇蘇州215123）

足底電擊加強大鼠凝血功能的研究*

程玉文，孫珮雯，朱晨潔，董濤，張國興
（蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院生理學系，江蘇蘇州215123）

摘要：目的研究足底電擊對大鼠凝血系統(tǒng)的影響及機制。方法以SD雄性大鼠足底電擊建立模型，分為對照組、電擊組、假手術組、去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組，每組6只大鼠。尾套法測量大鼠的收縮壓，凝血分析儀測定血漿凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）及血漿凝血酶（TT），血小板聚集儀測定二磷酸腺苷（ADP）介導血小板聚集和膠原介導血小板聚集，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血漿中脂質過氧化產物、谷胱甘肽、皮質酮濃度，觀察各項指標的變化。結果足底電擊大鼠7 d后，電擊組和假手術組收縮壓明顯高于對照組（P<0.05）。足底電擊14d后，電擊組和假手術組血漿中谷胱甘肽活性較對照組降低（P<0.05），電擊組和假手術組血漿中脂質過氧化物、皮質酮濃度相對于對照組升高（P<0.05），與對照組比較，電擊組和假手術組PT縮短，TT延長（P<0.05），電擊組和假手術組的ADP和膠原介導血小板聚集率高于對照組（P<0.05），電擊組和假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義。與電擊組比較，去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組收縮壓、血漿中脂質過氧化物、皮質酮濃度、ADP和膠原介導血小板聚集率降低（P<0.05）。結論足底電擊通過激活腎交感神經(jīng)和增加氧化應激使大鼠凝血功能增強。

關鍵詞：凝血功能；足底電擊；氧化應激；腎交感神經(jīng)

人們長期處于緊張焦慮狀態(tài)易導致心血管疾病，同時，抑郁焦慮會加速心血管疾病的形成。在過去的幾十年里，壓力和抑郁被公認是影響健康的重要因素[1]。壓力可能與腦卒中、心肌梗死密切相關[2]。大量研究表明,長期持續(xù)的應激可以對組織和器官造成器質性損傷[3]。腎交感神經(jīng)和氧化應激在應激性高血壓的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，高血壓可加重血管內皮功能障礙，促進血栓形成，與心腦血管疾病發(fā)病密切相關[4-5]。目前，關于精神應激與凝血系統(tǒng)、心腦血管疾病間的直接聯(lián)系，未見相關報道。凝血系統(tǒng)的激活與對生理性止血和病理性血栓形成有重要影響[6-7]。本研究計劃通過足底電擊大鼠建立應激模型[8]，探索大鼠凝血功能的變化及具體機制。

1　材料與方法

1.1動物

成年雄性SD大鼠24只，體重200～250 g，由蘇州大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為對照組、電擊組、假手術組、去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組，每組6只。選用一種超氧化物歧化酶模擬劑Tempol作為抗氧化劑，每天對去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組的大鼠腹腔注射該藥物100 mg/kg，濃度為10%，注射時間為電擊實驗前1 h。

1.2儀器和試劑

RBP21B型大鼠血壓心率儀購自北京新航興業(yè)科貿有限公司，半自動血凝分析儀購自廣州華鑫科技有限公司，血小板聚集儀購自上海曼普科技有限公司，ELISA檢測試劑盒購自美國R&D Systems公司。

1.3實驗方法

1.3.1模型制備①應激模型制備：電擊組大鼠刺激周期為15 d，每天上、下午各給予1次足底電刺激，2h/次，電流強度為2～4mA，電壓輸出為75～150 V；對照組大鼠每天于同樣時間置于相同的鼠箱，但不予應激刺激。②去神經(jīng)組模型制備：將雄性SD大鼠麻醉（腹腔注射1 ml/100 g的水合氯醛溶液）后，經(jīng)腰部縱行切口，沿腹膜后路徑暴露左側腎臟、腎動脈和腎神經(jīng)，于接近腹主動脈處的腎動脈和腎靜脈附近仔細游離出腎交感神經(jīng)，用手術剪切斷后縫合，右側同左側，術后靜養(yǎng)1周，去腎交感神經(jīng)大鼠模型制備成功。

1.3.2標本采集下腔靜脈取血或者斷頭取血5 ml，用3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝，混勻，置入-80℃保存全血標本備用。

1.3.3大鼠收縮壓測定實驗開始后每3天為1個周期，尾套法測定收縮壓。測量血壓前大鼠預置于38～40℃溫室10～20 min，尾部動脈擴張后，將尾部套于傳感器上，待動物適應環(huán)境、行為穩(wěn)定后，開主機電源。連續(xù)測3次，取其均值，每次測量在下午應激后0.5 h進行。

1.3.4大鼠凝血功能檢測靜脈采血1.8 ml，加入含有3.8%枸櫞酸鈉溶液0.2 ml的試管中，充分混勻，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，試管中加入預溫的SD大鼠凍干血漿和PT試劑各0.1 ml，混勻后放入儀器進行測試。TT、APTT測量方法同理，但是APTT測試時另加入25 mmol/L氯化鈣溶液0.1 ml。

1.3.5血小板聚集率使用血小板聚集儀測量血小板聚集率，靜脈采血0.9 ml，加入含有3.8%枸櫞酸鈉溶液0.1 ml的試管中，充分混勻，1 500 r/min離心15 min，分離血漿，分別用6×10-6mol/L二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）、20 mg/L膠原介導，實驗步驟參考血小板聚集儀操作手冊。

1.3.6血漿中脂質過氧化產物、皮質酮濃度、谷胱甘肽活性測定采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定皮質酮；使用4-羥基壬烯酸-His加合物ELISA檢測試劑盒測定脂質過氧化產物；使用皮質酮活性分析試劑盒測定皮質酮活性；使用谷胱甘肽過氧化酶ELISA測定試劑盒測定谷胱甘肽活性。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，各組均數(shù)作正態(tài)性檢驗及重復測量方差齊性檢驗，單因素方差分析進行組間比較（F檢驗），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組收縮壓隨電擊天數(shù)的變化

連續(xù)電擊7d后，電擊組和假手術組大鼠的血壓明顯高于對照組（P<0.05），這種狀態(tài)在后續(xù)1周的電擊中一直持續(xù)，提示足底電擊所造成的應激狀態(tài)可導致高血壓的發(fā)生。去神經(jīng)電擊組和注射抗氧化劑電擊組與電擊組比較，收縮壓明顯降低。假手術組與電擊組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示腎交感神經(jīng)和氧負離子在電擊誘導的高血壓中起重要作用。見圖1。

2.2各組血漿中脂質過氧化產物、谷胱甘肽活性、皮質酮濃度比較

電擊組和假手術組血漿中谷胱甘肽活性較對照組均有降低（P=0.010和0.008），提示機體電擊后抗氧化能力降低，機體處于超氧化狀態(tài)。電擊組和注射抗氧化劑電擊組血漿中谷胱甘肽活性較去神經(jīng)電擊組無明顯改變，但可顯著降低血漿中脂質過氧化產物濃度（P<0.05），提示去神經(jīng)和注射抗氧化劑無法提高機體自身的抗氧化能力，腎交感神經(jīng)激活可誘導機體氧化水平的失衡。皮質酮是常見的應激激素，能清晰地反應出應激水平，脂質過氧化產物濃度分析可反映脂質過氧化的水平。電擊組和假手術組血漿中脂質過氧化產物和皮質酮濃度相對對照組升高，說明長期電擊使機體產生大量氧自由基，腎上腺分泌大量皮質酮。注射抗氧化劑電擊組血漿中皮質酮濃度較電擊組有顯著降低（P<0.05），提示機體腎交感神經(jīng)激活引起的腎上腺分泌大量皮質酮釋放可能有氧負離子的參與。見表1。

2.3各組凝血指標比較

電擊組和假手術組血漿凝血酶時間（thrombin time，TT）較對照組延長（P=0.002和0.011），提示體內的抗凝物質增多，而血漿凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）則縮短，提示凝血酶原轉化為凝血酶時間縮短，內源性凝血系統(tǒng)激活所需時間變少，血栓更易形成。去神經(jīng)和抗氧化劑處理可以縮短TT（P=0.046和0.022），但對PT沒有影響。見表2。

2.4各組血小板聚集率比較

圖1　各組收縮壓隨電擊天數(shù)的變化

表1　各組血漿中脂質過氧化產物、谷胱甘肽活性及皮質酮濃度比較（n=6±s）

表1　各組血漿中脂質過氧化產物、谷胱甘肽活性及皮質酮濃度比較（n=6±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與電擊組比較，P<0.05

組別　脂質過氧化產物/（μmol/ml）　谷胱甘肽/ （u/L）　皮質酮/ （ng/ml）對照組　108.20±1.65　141.56±3.24 182.99±5.51電擊組　136.47±3.571）128.52±2.981）227.56±6.671）P值　0.000　0.010　0.000假手術組　138.49±3.071）127.38±2.931）230.52±4.431）P值　0.000　0.008　0.000去神經(jīng)電擊組　119.55±3.322）120.41±4.071）161.90±2.922）P值　0.002　0.001　0.000注射抗氧化劑電擊組　111.11±3.922）120.44±1.991）162.51±6.742）P值　0.000　0.000　0.000

表2　各組凝血指標比較（n=6，s±s）

表2　各組凝血指標比較（n=6，s±s）

注：1）與對照組比較，P<0.05；2）與電擊組比較，P<0.05

組別　TT　PT　APTT對照組　47.98±0.55　11.97±0.47 19.85±0.14電擊組　64.65±2.751）　10.4±0.151）19.05±0.87 P值　0.002　0.021　0.673假手術組　53.52±3.031）　11.22±0.921）20.22±0.98 P值　0.011　0.070　0.728去神經(jīng)電擊組　56.30±2.412）　11.03±0.52 19.72±1.26 P值　0.046　0.327　0.673注射抗氧化劑電擊組　53.25±3.162）　11.25±0.35 18.28±2.11 P值　0.022　0.077　0.752

電擊組和假手術組的ADP和膠原介導血小板聚集率均高于對照組（P<0.05），提示電擊能激活血小板的聚集。去神經(jīng)和注射抗氧化劑處理均可以抑制電擊引起的ADP和膠原介導的血小板聚集率升高，電擊組與假手術組的血小板聚集率比較，差異無統(tǒng)計學意義，排除開腹手術的影響，提示電擊引起的凝血功能的改變是由腎交感神經(jīng)及氧負離子介導。見圖2。

圖2　各組血小板聚集率

3　討論

本實驗前期基礎研究表明，長期足底電擊導致大鼠血壓升高形成應激性高血壓，腎交感神經(jīng)和氧化應激在其發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。高血壓可加重血管內皮功能障礙，促進血栓形成，與心腦血管疾病發(fā)病密切相關，交感神經(jīng)與氧化應激在心腦血管疾病中發(fā)揮的作用不容小覷。

凝血是一系列血漿凝血因子相繼酶解激活的過程，最終結果是生成凝血酶，形成纖維蛋白凝塊[9]。凝血過程一般分為內源性凝血和外源性凝血。APTT是內源性凝血系統(tǒng)的篩選實驗；PT是外源凝血系統(tǒng)凝血因子缺陷的過篩實驗；TT是凝血酶原轉變成凝血酶的時間。TT和APTT的延長提示凝血功能下降[10]。本實驗結果顯示，應激狀態(tài)下TT和APTT都延長，可能是由于應激造成凝血相關環(huán)節(jié)損傷，且與凝血酶的生成時間延長關系密切，從而造成凝血時間延長，但本實驗中該差異無統(tǒng)計學意義。而PT的縮短則表明外源性凝血系統(tǒng)易于激活，啟動凝血機制，且差異有統(tǒng)計學意義。

血小板主要來源于巨核細胞，在初級止血中起重要作用，血小板發(fā)生聚集后，產生凝血功能[11]。血小板通過各種黏附、聚集、釋放反應，產生止血功能[12]。血小板聚集增強說明凝血功能增強。血小板聚集是動脈硬化發(fā)生、發(fā)展和血栓形成的重要環(huán)節(jié)[13-14]。

1985年有學者提出激素學說，該學說認為應用激素引起血液高凝，導致血管內血栓形成，造成微循環(huán)阻塞。本實驗中測得血漿中皮質酮濃度在電擊后增加，說明電擊后在應激激素皮質酮作用下，血液處于高凝狀態(tài)，而切斷腎交感神經(jīng)后，減弱腎皮質激素的釋放緩解這種高凝狀態(tài)。谷胱甘肽的減少、脂質過氧化產物的增加均提示機體處于超氧化水平，血管內皮損傷為血小板聚集創(chuàng)造有利條件，所以氧自由基增加，致使血液處于高凝狀態(tài)。

綜上所述，足底電擊導致大鼠血壓的升高，激活凝血系統(tǒng)，引起微循環(huán)障礙，導致心腦血管疾病。凝血系統(tǒng)的激活有兩條途徑：①應激使機體產生大量脂質過氧化產物，抑制抗氧化劑谷胱甘肽的產生，使機體處于超氧化狀態(tài)，血管內皮受損，血小板活化聚集率增高，血栓易于形成；②應激狀態(tài)下交感神經(jīng)釋放皮質激素，血液處于高凝狀態(tài)。但是應激對凝血時間的影響是否具有意義，以及其具體環(huán)節(jié)有待進一步研究。應激激活凝血系統(tǒng)后，可以通過增加血栓數(shù)量，誘發(fā)腦卒中和冠狀動脈粥樣硬化性心臟病；另外動脈粥樣硬化也增加心肌梗死的發(fā)病率，因此可以在神經(jīng)激素水平和抗氧化劑水平上，對心腦血管方面的疾病進行預防和治療。

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（申海菊編輯）

Foot shock potentiates blood coagulation system of rats*

Yu-wen CHENG, Pei-wen SUN, Chen-jie ZHU, Tao Dong, Guo-xing ZHANG (Department of Physiology and Neurobiology, Medical College of Soochow University, Suzhou, Jiangsu 215123, P.R. China)

Abstract:【Objective】To observe the influence of foot shock on blood coagulation system of rats. 【Methods】A foot shock model was established in male Sprague Dawley (SD) rats. They were divided into control group, foot shock group, sham group, renal sympathetic nerve denervation plus foot shock group and tempol plus foot shock group with 6 in each group. Tail-cuff method was applied to measure the systolic blood pressure in the rats. Semi-automatic blood coagulation analyzer was applied to measure TT, PT and APTT. Platelet aggregation instrument was used to measure ADP and collagen induced platelet aggregation. Concentrations of plasma thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), corticosterone and glutathione peroxidase activity (GSH-Px) were measured by ELISA kits.【Results】The systolic blood pressure of the shock group and the sham group was significantly higher than that of the control group 7 days after foot shock (P< 0.05). The plasma GSH-Px activity was decreased in the shock group and the sham group compared to that in the control group 14 days after foot shock (P< 0.05). The plasma concentrations of TBARS and corticosterone were increased in the foot shock group and the sham group compared with that in the control group (P< 0.05). PT of the foot shock group and the sham group was shortened compared with that in the control group, but TT was extended (P< 0.05). Platelet aggregation rates induced ADP and collagen in the foot shock group and the sham group were significantly higher than those in the control group (P< 0.05), however, there were no significant differences in the rates between the shock group and the sham group. Both renal sympatheticbook=19,ebook=25denervation and tempol treatments reduced systolic blood pressure, plasma TBARS and corticosterone level, and ADP and collagen induced rates of platelet aggregation compared with the shock group (P< 0.05).【Conclusion】Foot shock of rats enhances blood coagulation system through renal sympathetic nerve system activation and increase of oxidative stress.

Key words:coagulation function; foot shock; oxidative stress, renal sympathetic nerve system

[通信作者]張國興，E-mail：zhangguoxing@suda.edu.cn

*基金項目：國家級大學生創(chuàng)新訓練項目（No：2013suda038）

收稿日期：2014-12-30

文章編號：1005-8982（2015）23-0018-05

中圖分類號：R363

文獻標識碼：A