馮浩，馮亞蘭，曠翎，徐曉芃，賈曉敏，吳東輝（.湖南省人民醫(yī)院皮膚科，湖南長沙0005；.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州000；.湖南省人民醫(yī)院病理科，湖南長沙0005；.湖南省人民醫(yī)院整形美容科，湖南長沙0005）

環(huán)氧化酶-2與p53在惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)意義及相關(guān)性分析*

馮浩1，馮亞蘭2，曠翎1，徐曉芃1，賈曉敏3，吳東輝4
（1.湖南省人民醫(yī)院皮膚科，湖南長沙410005；2.湖南省郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州423000；3.湖南省人民醫(yī)院病理科，湖南長沙410005；4.湖南省人民醫(yī)院整形美容科，湖南長沙410005）

摘要：目的探討惡性黑色素瘤組織中環(huán)氧化酶-2（COX-2）與p53的表達(dá)，明確其在惡性黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義。方法收集惡性黑色素瘤組織和色素痣患者各30例，采用免疫組織化學(xué)檢測組織中COX-2和p53表達(dá)，并與臨床資料進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果COX-2和p53蛋白在惡性黑色素瘤組織中表達(dá)陽性率高于色素痣組（P<0.01）。惡性黑色素瘤組織中COX-2與p53的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.452，P=0.015）。惡性黑色素瘤中COX-2表達(dá)在年齡、性別分組中，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而惡性黑色素瘤病理分期Ⅲ、Ⅳ期患者的COX-2陽性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.01）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的COX-2陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。結(jié)論COX-2可能為判定MM惡性程度的一種標(biāo)志，可能通過p53突變，導(dǎo)致COX-2表達(dá)增強(qiáng)，從而在惡性黑色素瘤中發(fā)生作用。

關(guān)鍵詞：惡性黑色素瘤；COX-2；p53；臨床意義

臨床上，惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）呈逐年增多的趨勢，目前將其臨床發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究轉(zhuǎn)至對分子途徑的研究[1]。組織學(xué)中MM有血管增生，其新生血管增生與多種促血管因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化酶-2（Cyclooxygenase，COX-2）表達(dá)與MM發(fā)展有關(guān)[2-4]。本研究主要探討COX-2和p53在MM中的表達(dá)及臨床意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選取2011年1月-2014年6月在湖南省人民醫(yī)院、長沙市中醫(yī)醫(yī)院（市八醫(yī)院）和長沙市馬王堆療養(yǎng)院門診及住院診斷為MM的患者30例，均經(jīng)臨床、病理活檢及免疫組織化學(xué)（S-100和HMB45陽性）確診。其中男性22例，女性8例；年齡29～82歲，平均51歲；病程2～36個(gè)月，平均10個(gè)月。收集并記錄患者臨床資料，根據(jù)惡性黑色素瘤TNM分期（美國癌癥聯(lián)合委員會第7版），Ⅰ、Ⅱ期11例，Ⅲ、Ⅳ期19例。色素痣組30例來自湖南省人民醫(yī)院皮膚科與整形外科門診色素痣患者。其中皮內(nèi)痣12例，交界痣9例，混合痣9例；男性11例，女性19例；年齡18～62歲，平均46歲。兩組患者年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。所有患者切除的組織立即放入4%福爾馬林液固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片，覆蓋于多聚賴氨酸處理過的玻片上備用。

1.2免疫組織化學(xué)法檢測組織中COX-2和p53表達(dá)

COX-2和p53單克隆抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。采用Envision兩步法：石蠟常規(guī)切片，二甲苯脫蠟梯度酒精水化后放進(jìn)水浴鍋中，100℃、40 min行抗原熱修復(fù)，切片滴加3%鏈酶菌抗生物素-過氧化物酶溶液孵育20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片分別滴加COX-2和p53一抗工作液，孵育1 h后再以Envision/辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）（即用型試劑）室溫孵育30～45 min。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗，每次5 min，共沖洗3次，二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色，在光鏡下控制，顯色充分后用自來水終止。蘇木精復(fù)染1 min，常規(guī)水性封片劑封片。以購買的陽性片作為陽性對照組，以PBS代替一抗作為陰性對照組。

陽性標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞漿內(nèi)（COX-2）或細(xì)胞核內(nèi)（p53）出現(xiàn)棕黃色或棕褐色反應(yīng)物顆粒即為陽性。每張切片觀察5個(gè)獨(dú)立高倍視野（×400），根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定陰性或陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析用Kendalls’taub等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1COX-2的表達(dá)

30例MM組患者中，COX-2陽性24例（80.00%）；30例色素痣組患者中，COX-2陽性4例（13.33%）。兩組COX-2陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。見圖1A和表1。

2.2p53的表達(dá)

MM組p53陽性22例，達(dá)73.33%；色素痣組p53陽性7例，為23.33%。兩組p53陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。見圖1B和表2。

2.3MM組中COX-2與p53表達(dá)的相關(guān)性

附圖　惡性黑素瘤組織中COX-2與p53表達(dá)（免疫組織化學(xué)）

表1　兩組患者COX-2表達(dá)比較例

24例COX-2陽性表達(dá)的MM組織中，p53陽性表達(dá)20例；6例COX-2陰性表達(dá)的MM組織中，p53陽性表達(dá)2例；經(jīng)相關(guān)性分析，MM組織中COX-2與p53的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.452，P=0.015）。見表3。

2.4COX-2與MM患者臨床資料的相關(guān)性

觀察COX-2與患者年齡、性別、病理分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果顯示，中COX-2陽性率與MM患者的年齡、性別不相關(guān)（P>0.05）。而MM病理分期Ⅲ、Ⅳ期患者的COX-2陽性率顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.01）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的COX-2陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05）。見表4。

表2　兩組患者p53表達(dá)比較　例

表3　MM組織中COX-2與p53表達(dá)的相關(guān)性例

表4　COX-2與MM患者臨床資料的相關(guān)性例（%）

3　討論

目前，對分子標(biāo)記用于區(qū)分色素痣和MM的關(guān)注越來越多，尤其是早期發(fā)現(xiàn)和治療MM的標(biāo)記物。COX-2為炎癥性的誘導(dǎo)型酶，某些物質(zhì)可以誘導(dǎo)其在體內(nèi)組織中產(chǎn)生，如炎癥細(xì)胞因子、腫瘤啟動因子、生長因子和致癌物質(zhì)等。COX-2在正常組織中一般無表達(dá)，而在腫瘤組織中高度表達(dá)，提示其可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并且多表達(dá)于惡性生長的上皮細(xì)胞[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，COX-2與胃癌、乳腺癌、人肝細(xì)胞肝癌、結(jié)直腸癌、鱗狀細(xì)胞癌等密切相關(guān)[6-10]。COX-2表達(dá)高的腫瘤細(xì)胞對凋亡抵抗、血管形成因子生成、轉(zhuǎn)移以及促血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的能力增強(qiáng)。COX-2催化產(chǎn)生前列腺素E2并產(chǎn)生一系列效應(yīng)，如細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成、抑制細(xì)胞凋亡、刺激腫瘤侵襲和抑制免疫應(yīng)答[11-12]。有報(bào)道稱COX-2可能有助于區(qū)分皮膚黑素瘤與色素痣[13]。鑒于通過組織病理形態(tài)學(xué)很難明確區(qū)分良、惡性病變，COX-2鑒別早期皮膚黑素瘤和色素痣的研究就顯得極為有意義。

關(guān)于MM中COX-2的作用機(jī)制少有報(bào)道。近年有研究發(fā)現(xiàn)，COX-2高表達(dá)可能與MM的進(jìn)展有關(guān)[14]。而COX-2蛋白在原發(fā)性黑素瘤中未檢出，在周圍炎癥細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性腫瘤中卻有少許表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，MM組中COX-2表達(dá)（80.00%）明顯高于色素痣組（P<0.01），同時(shí)病理分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MM中COX-2表達(dá)相關(guān)（P<0.05），TNM分期高和/或伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者陽性率高。類似研究證實(shí)，乳腺癌中COX-2表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，胃癌原發(fā)灶中COX-2的陽性表達(dá)與胃癌TNM分期密切相關(guān)[15-16]。此外，COX-2高表達(dá)可降低介導(dǎo)細(xì)胞間黏附的E-鈣黏蛋白活性，提高細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白黏附能力，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲力；相反使用COX -2抑制劑能增加E-鈣黏蛋白活性[17]。因此COX-2高表達(dá)可能與黑素瘤細(xì)胞侵襲能力和轉(zhuǎn)移性生長有關(guān)。COX-2有可能成為評估MM患者病情與預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。

目前已發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，如促凋亡基因p53、Fas/FasL、Noxa、p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體等。其中p53基因是一種功能強(qiáng)大的可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的抑癌基因，其分為突變型基因和野生型基因兩種。突變型p53基因較野生型更穩(wěn)定，能在免疫組織化學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)。因此在組織中有高表達(dá)p53蛋白，即表明有p53基因的突變[18]。p53基因在黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。正常條件下，p53基因產(chǎn)物可抑制COX-2的表達(dá)，而p53基因突變的細(xì)胞，COX-2表達(dá)增強(qiáng)。本研究顯示，MM組p53的陽性表達(dá)率為73.33%，高于色素痣組p53的表達(dá)（23.33%）（P<0.01），與其他文獻(xiàn)報(bào)道相似[19]，且MM組織中COX-2與p53表達(dá)呈正相關(guān)。

綜上所述，MM中COX-2高表達(dá)可能是一種生物學(xué)惡性程度高、預(yù)后不良的標(biāo)志，可能通過p53突變而使COX-2抑制減弱，導(dǎo)致其表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)腫瘤新生血管形成，腫瘤細(xì)胞凋亡減少，從而促進(jìn)MM的發(fā)生、發(fā)展。因此，研究COX-2可能為早期診斷MM、觀察該病發(fā)生與進(jìn)展、預(yù)判腫瘤的惡性程度提供重要參考依據(jù)。

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（申海菊編輯）

Clinical value of expressions of COX-2 and P53 in malignant melanoma*

Hao FENG1, Ya-lan FENG2, Ling KUANG1, Xiao-peng XU1, Xiao-min JIA3, Dong-hui WU4(1. Department of Dermatology, Hunan Provincial People's Hospital, Changsha, Hunan 410005, P.R. China; 2. The First People's Hospital of Chenzhou, Chenzhou, Hunan 423000, P.R. China;
3. Department of Pathology, 4. Department of Plastic Surgery, Hunan Provincial People's Hospital, Changsha, Hunan 410005, P.R. China)

Abstract:【Objective】To observe the clinical value of the expressions of COX-2 and P53 in malignant melanoma (MM).【Methods】Thirty patients with MM and thirty cases of nevus were collected. The expressions of COX-2 and P53 were detected by immunohistochemical method and the correlation between the expression of COX-2 and clinical data was analyzed.【Results】The expressions of COX-2 protein and P53 protein in MM tissue were statistically higher than those in nevus (P< 0.01). There was a statistically significant positive correlation between the expression of COX-2 and P53 (r = 0.452, P< 0.05). There was no statistically differences of COX-2 expression in MM patients with different age and gender (P> 0.05), while the positive rate of COX-2 in the stageⅢandⅣMM patients was significantly higher than that in the stageⅠandⅡpatients (P< 0.01). The positive rate of COX-2 in the patients with lymph node metastasis was higher than that in the patients without lymph node metastasis (P< 0.05).【Conclusion】COX-2 may become a new symbol for judging the malignant degree of malignant melanoma, which is supposed to be activated by p53 mutation.

Key words:malignant melanoma; COX-2; P53; clinical value

[通信作者]吳東輝，E-mail：doctorwudonghui@126.com

*基金項(xiàng)目：湖南省自然科學(xué)基金青年基金（No：09JJ4011）；湖南省人民醫(yī)院仁術(shù)科研基金（No：2008-14）

收稿日期：2015-02-17

文章編號：1005-8982（2015）23-0028-04

中圖分類號：R739.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A