楊占甲（河南省鄭州人民醫(yī)院輸血科，河南鄭州450000）

Th17及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在急性白血病外周血中的表達(dá)及預(yù)后意義

楊占甲
（河南省鄭州人民醫(yī)院輸血科，河南鄭州450000）

摘要：目的研究Th17細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在急性白血?。ˋL）外周血中的表達(dá)水平，并初步探討其與疾病預(yù)后的關(guān)系。方法選取2011年6月-2013年6月在該院診斷為AL的40例患者為研究組，同時(shí)選取來(lái)該院體檢的健康人群為對(duì)照組（40例），采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AL患者及正常體檢者外周血中Th17細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞水平，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)兩組外周血中IL-17和TGF-β水平；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)兩組外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT及Foxp3 mRNA水平。此外，該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AL化療后緩解的Th17及CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞及相關(guān)因子水平。結(jié)果研究組外周血中Th17（CD3+CD4+IL-17+）細(xì)胞比例為（1.51±0.27）%，顯著高于對(duì)照組[（0.36±0.23）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.51，P=0.000）；研究組外周血中CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例為（3.37±0.48）%，顯著高于對(duì)照組[（1.26± 0.27）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.23，P=0.000）。研究組血清IL-17為（28.12±6.33）pg/ml，顯著高于對(duì)照組[（14.41±6.21）pg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.78，P=0.000）；研究組血清TGF-β為（38.41±8.44）pg/ml，顯著高于對(duì)照組[（24.49±7.42）pg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.83，P=0.000）。研究組外周血中RORγT mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =12.27，P=0.000）；研究組外周血中Foxp3 mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.89，P=0.000）。與化療前比較，化療6個(gè)月后研究組Th17細(xì)胞及CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞水平降低，血清IL-17以及TGF-β水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論AL患者的Th17細(xì)胞、CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞及其分泌蛋白IL-17、TGF-β和轉(zhuǎn)錄因子顯著增加，定期檢測(cè)外周血中Th17、Treg細(xì)胞及其分泌蛋白有助于對(duì)患者的免疫狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)判。

關(guān)鍵詞：Th17；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；IL-17；TGF-β；急性白血病

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是臨床上發(fā)病比較急驟的一種常見(jiàn)的嚴(yán)重血液性疾病，包括急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）和急性非淋巴細(xì)胞白血?。╝cute nonlymphocyticl eukemia，ANLL）[1]。AL的臨床表現(xiàn)多種多樣，最為常見(jiàn)的是出血，出血部位可遍及全身，以口腔、鼻腔、皮下多見(jiàn)。血小板減少是出血的重要原因，而腦出血常常導(dǎo)致死亡。如果搶救不及時(shí)，很容易危及生命，因此對(duì)AL發(fā)病機(jī)制以及臨床診療的研究至關(guān)重要。

CD4+T細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞，在抗原與抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）存在時(shí)，可以主要分化為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）[1-4]。其中，Th17是一群在TCR通路和細(xì)胞因子IL-6及TGF-β刺激下分化的亞群[5]；而Treg細(xì)胞則是一類調(diào)控機(jī)體免疫功能的細(xì)胞群，能維持免疫系統(tǒng)對(duì)自身成分的耐受，使機(jī)體保持免疫穩(wěn)態(tài)，這類細(xì)胞表達(dá)Foxp3、CD25及CD4。經(jīng)研究證實(shí)Th17 和Treg細(xì)胞的平衡在感染、腫瘤、器官移植、同種異體胎兒免疫等疾病方面，有抑制各種途徑的病理生理免疫應(yīng)答作用[6-10]。目前，對(duì)Th17及CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞與AL的預(yù)后關(guān)系研究尚少，因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較AL患者與正常體檢者外周血中Th17、Treg細(xì)胞及分泌的因子水平，并同時(shí)檢測(cè)化療前后Th17、Treg細(xì)胞的變化，探討其與疾病預(yù)后關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選擇2012年8月-2014年8月在河南省鄭州人民醫(yī)院診斷為AL的患者40例為研究組。其中男性21例，女性19例；年齡32～58歲，平均（41.21± 12.13）歲；ANLL 25例，ALL 15例。經(jīng)化療完全緩解17例，男性6例，女性11例；年齡36～54歲，平均（45.26±9.24）歲。AL的診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)參考第2版《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。對(duì)照組40例來(lái)自本院健康體檢者，無(wú)心、肝、肺、腎等重要臟器疾病，血常規(guī)及肝腎功能檢查正常，其中男性23例，女性17例；年齡31～56歲，平均（43.12±11.25）歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2主要試劑

采用上海英駿公司Trizol試劑盒提取RNA，采用美國(guó)Femantes公司cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒購(gòu)于南京生興生化科技有限公司，大鼠抗人CD3-APC、CD4-FITC、IL-17-PE、CD25-APC、FoxP3-PE流式抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自武漢博士德公司，破膜固定劑（Fix/Perm Cell Permeabilization Kit）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑（Golgi Stop）購(gòu)自BD公司，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)用的不完全1640培養(yǎng)液、胎牛血清以及青霉素-鏈霉素（P-S雙抗）等購(gòu)自上海麥倉(cāng)生物科技有限公司，使用前按照89∶10∶1比例配制成完全1640培養(yǎng)液。

1.3治療

研究組化療方案：①ANLL患者采用DA（柔紅霉素+阿糖胞苷）或HA（高三尖杉酯堿+阿糖胞苷）方案；②ALL患者采用VCDP（長(zhǎng)春新堿+環(huán)磷酰胺+柔紅霉素+潑尼松）方案。

1.4方法

1.4.1Th17和Treg細(xì)胞流式染色兩組患者在早晨空腹采集抗凝和不抗凝靜脈血各2 ml，加入紅細(xì)胞裂解液后，以完全1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106/ml。Th17細(xì)胞染色：離心并重懸于100μl PBS中，加入CD3-APC（0.2 mg/ml）和CD4-FITC （0.25 mg/ml）抗體，混勻后室溫避光孵育40 min，PBS 洗1遍，加入破膜固定工作液1 ml后，4℃避光孵育40 min。離心后，重懸于100μl Permeabilization buffer中，加入IL-17-PE（0.25 mg/ml），4℃避光孵育30 min，PBS緩沖液洗1遍，以400μl緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，美國(guó)BD公司）檢測(cè)。Treg細(xì)胞染色：離心并重懸于100μl PBS中，加入CD25-APC（0.25 mg/ml）和CD4-FITC（0.25 mg/ml）抗體，混勻后室溫避光孵育40 min，PBS洗1遍，加入破膜固定工作液1 ml后4℃避光孵育40 min。離心后，重懸于100μl Permeabilization buffer中，加入2μl FC受體阻斷劑，4℃避光孵育20 min，加入抗FoxP3-PE（0.15 mg/ml）抗體，置4℃避光孵育40 min，PBS緩沖液洗1遍，以400μl緩沖液重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.2檢測(cè)血清IL-17及TGF-β濃度酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)血清IL-17及TGF-β濃度，所有試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為有限公司，檢測(cè)流程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4.3檢測(cè)外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT mRNA 和Foxp3 mRNA水平采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法，外周血離心后提取上層血漿200μl，加入1 ml Trizol充分勻漿，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作，所得RNA溶于20μl DEPC處理水。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量分析。然后采用Femantes逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩１緦?shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性20 s，60℃變性20 s，70℃退火1 s，共40個(gè)循環(huán)。RORγT引物序列為：正向5'-GCAATGGAAGTGGTGCTGGTT-3'，反向：5'-AGGATGCTTTGGCGATGAGTC-3'；Foxp3引物序列為：正向5'-CACGCATGTTTGCCTTCTTCAGA-3'，反向：5'-GTAGGGTTGGAACACCTGCTGGG-3'；內(nèi)參GAPDH引物序列為：正向5'-ATCTGGCACCACACC TTC-3'，反向：5'-AGCCAGGTCCAGACGCA-3'。使用ABI公司的7300型號(hào)Real-Time PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增，所得結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析[11]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組患者外周血中Th17及Treg細(xì)胞比例比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，對(duì)照組外周血中Th17細(xì)胞比例為（0.36±0.23）%，顯著低于研究組[（1.51± 0.27）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =20.51，P=0.000）；對(duì)照組外周血中Treg細(xì)胞比例為（1.26±0.27）%，顯著低于研究組[（3.37±0.48）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.23，P=0.000）。見(jiàn)圖1。

2.2兩組患者血清細(xì)胞因子IL-17及TGF-β水平比較

ELISA法結(jié)果顯示，研究組血清IL-17為（28.12±6.33）pg/ml，顯著高于對(duì)照組[（14.41±6.21）pg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t =9.78，P=0.000）；研究組血清TGF-β為（38.41±8.44）pg/ml，顯著高于對(duì)照組[（24.49±7.42）pg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 7.83，P=0.000）。見(jiàn)圖2。

2.3兩組患者外周血中轉(zhuǎn)錄因子RORγT mRNA 及Foxp3 mRNA水平比較

RT-PCR檢測(cè)兩組患者外周血細(xì)胞中Th17及Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究組外周血RORγT mRNA及Foxp3 mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=12.27，t2=7.89，P= 0.000）。說(shuō)明Th17及Treg細(xì)胞在AL中發(fā)揮重要作用。見(jiàn)圖3。

2.4急性白血病患者化療前后各指標(biāo)比較

圖1　兩組患者外周血中Th17及Treg細(xì)胞比例

化療后，40例AL患者中有17例效果顯著為緩解組，其余23例為無(wú)效組。緩解組治療后Th17和Treg細(xì)胞比例顯著降低（見(jiàn)表1）。緩解組治療后血清IL-17及TGF-β水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。緩解組治療后外周血中RORγT mRNA 及Foxp3 mRNA水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表3）。

圖2　兩組患者血清IL-17及TGF-β水平

圖3　兩組人群外周血中RORγT及Foxp3 mRNA的水平

表1　AL患者化療前后Th17及Treg細(xì)胞比例的比較（%±s）

表1　AL患者化療前后Th17及Treg細(xì)胞比例的比較（%±s）

注：1）與治療前比較，t=4.90，P=0.000；2）與治療前比較，t=7.02，P=0.000

組別　Th17細(xì)胞　Treg細(xì)胞緩解組（n=17）治療前　1.45±0.23　3.21±0.34化療后　1.01±0.291）　2.08±0.572）無(wú)效組（n=23）治療前　1.65±0.26　3.47±0.51化療后　1.71±0.31　3.61±0.77

表2　AL患者化療前后血清IL-17及TGF-β水平的比較（pg/ml，±s）

表2　AL患者化療前后血清IL-17及TGF-β水平的比較（pg/ml，±s）

注：1）與治療前比較，t=2.32，P<0.05；2）與治療前比較，t=5.26，P=0.000

組別　IL-17　TGF-β緩解組（n=17）治療前　25.43±7.12　36.17±7.35化療后　20.08±6.281）　22.41±7.892）無(wú)效組（n=23）治療前　31.13±8.12　38.41±8.44化療后　32.21±9.67　36.78±9.16

表3　AL患者化療前后外周血中RORγT mRNA及Foxp3 mRNA水平的比較（±s）

表3　AL患者化療前后外周血中RORγT mRNA及Foxp3 mRNA水平的比較（±s）

注：1）與治療前比較，t=7.00，P=0.000；2）與治療前比較，t=9.41，P=0.000

組別　RORγT mRNA　Foxp3 mRNA緩解組（n=17）治療前　1.25±0.35　1.21±0.31化療后　0.51±0.261）　0.38±0.192）無(wú)效組（n=23）治療前　1.31±0.31　1.28±0.25化療后　1.27±0.241）　1.33±0.352）

3　討論

AL是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫水平異常有密切關(guān)系，尤其是細(xì)胞免疫的異常。Th17及CD4+CD25+Treg細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞經(jīng)APC誘導(dǎo)分化的兩大類極其重要的免疫細(xì)胞亞群。其中，Th17是一群在TGF-β、IL-6誘導(dǎo)下產(chǎn)生的細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病和機(jī)體防御反應(yīng)中有重要意義[10]。而Treg細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型免疫抑制細(xì)胞，來(lái)源于胸腺外周血中持續(xù)性抗原刺激、IL-10和/或TGF-β等細(xì)胞因子條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生，該亞群具有極其重要的免疫調(diào)節(jié)功能，參與機(jī)體多種生理、病理的免疫調(diào)節(jié)作用[8，10，12]。

近年來(lái)，Th17及Treg細(xì)胞在腫瘤相關(guān)疾病中的作用受到廣泛關(guān)注。DUAN等[9]認(rèn)為在肺癌中，Th17 及Treg細(xì)胞顯著增加，兩者有相關(guān)性。CHEN等[13]發(fā)現(xiàn)在維吾爾族的宮頸癌患者中，Th17及Treg細(xì)胞顯著增加，Th17/Treg細(xì)胞比率改變，打破體內(nèi)Th17/reg細(xì)胞平衡。但是Th17及Treg細(xì)胞在AL患者的表達(dá)及其化療后的變化報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)在AL患者的Th17及Treg細(xì)胞水平顯著高于正常人群。提示Th17及Treg細(xì)胞參與AL患者的免疫應(yīng)答，并可能對(duì)患者的免疫功能有重要調(diào)節(jié)作用，參與AL的進(jìn)展。IL-17及TGF-β分別是Th17及Treg細(xì)胞特異性分泌的功能因子，檢測(cè)兩組患者血清IL-17及TGF-β水平發(fā)現(xiàn)，研究組血清IL-17及TGF-β的表達(dá)高于對(duì)照組，提示Th17及Treg細(xì)胞可能通過(guò)分泌相應(yīng)的功能因子參與AL的致病過(guò)程。而RORγT和Foxp3不僅是Th17和Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志，同時(shí)還是決定Th17及Treg細(xì)胞功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄基因[14]，因此，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組患者外周血中RORγT mRNA及Foxp3 mRNA水平，發(fā)現(xiàn)研究組外周血中RORγT mRNA及Foxp3 mRNA水平高于對(duì)照組，進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果。LI等[15]發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中Th17及Treg細(xì)胞顯著增加，并表達(dá)高水平的IL-17及TGF-β，與臨床病理參數(shù)相關(guān)，從側(cè)面支持本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

為觀察Th17及Treg細(xì)胞是否參與AL的預(yù)后，筆者對(duì)化療后緩解的17例AL患者進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)緩解組患者的Th17及Treg細(xì)胞、相關(guān)因子及轉(zhuǎn)錄因子顯著降低，而無(wú)效組患者治療前后各項(xiàng)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示AL治療效果及預(yù)后在很大程度上與患者體內(nèi)免疫細(xì)胞Th17、Treg的表達(dá)水平及功能因子有關(guān)。

綜上所述，Th17、Treg細(xì)胞及其相關(guān)因子在AL的致病過(guò)程中發(fā)揮重要功能，其增加可能是臨床上AL并發(fā)癥及死亡的重要原因，并且與AL的預(yù)后有密切關(guān)系，對(duì)臨床診療及預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。

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（童穎丹編輯）

Expressions of Th17 cells and CD4+CD25+T regulatory cells in peripheral blood of acute leukemia patients and their prognostic significance

Zhan-jia YANG
(Department of Blood Transfusion, Zhengzhou People's Hospital, Zhengzhou, Henan 450000, P.R. China)

Abstract:【Objective】To study the expressions of Th17 cells and CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in the peripheral blood in acute leukemia (AL) patients and to explore their links with the prognosis of AL. 【Methods】A total of 40 AL patients in our hospital were enrolled into study group, 40 healthy volunteers were used as control group. Flow cytometry was used to detect peripheral blood Th17 cells and CD4+CD25+Foxp3+cell levels, and the serum levels of IL-17 and TGF-β were detected by ELISA. RT-PCR assay was used to analyze mRNA levels of ROR γ T and Foxp3 in both groups.【Results】The Th17 cell ratio in the patients with acute leukemia was significantly higher than that in the control group (t= 20.51, P= 0.000). The CD4+CD25+Foxp3+cell ratio in the patients with acute leukemia was significantly higher than that in thebook=67,ebook=73control group(t = 24.23, P = 0.000). The serum levels of IL-17 and TGF-β in the patients with acute leukemia were significantly higher than those in the control group (P= 0.000). In addition, the mRNA levels of ROR γ T and Foxp3 in the patients with acute leukemia were significantly higher than those in the control group (P= 0.000). After chemotherapy, the levels of Th17 and CD4+CD25+Foxp3+cells, the serum levels of IL-17 and TGF-β, and transcription factors in the patients with acute leukemia were decreased with statistical differences (P< 0.01).【Conclusions】Th17 cells and CD4+CD25+Foxp3+cells and related genes are increased in patients with acute leukemia. Periodic testing of Th17 and regulatory T cells may help monitoring immune status and evaluation of outcomes of AL patients.

Key words:Th17; regulatory T cells; IL-17; TGF-β; acute leukemia

收稿日期：2015-03-26

文章編號(hào)：1005-8982（2015）23-0066-05

中圖分類號(hào)：R733.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A