陳　潁　周家德

Toll樣受體9在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)及抗凋亡作用

陳潁周家德

[摘要]目的研究宮頸癌Hela細(xì)胞中Toll樣受體9(TLR9)的表達(dá)情況及TLR9對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞抗凋亡能力的影響，尋求宮頸癌免疫治療的新途徑。方法體外培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞株，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Hela細(xì)胞中TLR9 mRNA的表達(dá)情況；四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測(cè)不同濃度人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)CpG-ODN預(yù)刺激對(duì)Hela細(xì)胞抗TRAIL誘導(dǎo)凋亡能力的影響。結(jié)果①TLR9 mRNA在Hela細(xì)胞中表達(dá)，應(yīng)用CpG-ODN刺激24 h后，TLR9 mRNA的表達(dá)增加，與PBS對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②MTT比色法檢測(cè)顯示，TRAIL蛋白可抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，隨著TRAIL蛋白濃度增加，抑制率增加。并且計(jì)算半抑制濃度IC50(223.092±3.850) ng/mL。③流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，TLR9特異性激動(dòng)劑CpG-ODN刺激Hela細(xì)胞后，TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率為(15.32±2.46)%，與無CpG-ODN預(yù)刺激組[(43.49±2.04)%]相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論TLR9特異性激動(dòng)劑CpG-ODN能夠增強(qiáng)Hela細(xì)胞抵抗TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能力，提示TLR9在腫瘤的惡性進(jìn)程中發(fā)揮作用，為宮頸癌的免疫治療提供新的思路。

[關(guān)鍵詞]宮頸癌；Hela細(xì)胞；Toll樣受體9；細(xì)胞凋亡；CpG-ODN

作者單位： 230032合肥安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中占第2位，僅次于乳腺癌。近年來，宮頸癌的發(fā)病率呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)和年輕化趨勢(shì)。雖然目前有手術(shù)、化療和放療等多種綜合治療手段，但宮頸癌患者5年生存率并無明顯提高。因此，尋找新的預(yù)防和治療方法成為宮頸癌的迫切問題。Toll樣受體(TLRs)是近年來備受關(guān)注的一種細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)跨膜受體，Toll樣受體9(TLR9)是TLRs家族重要成員。相對(duì)于正常宮頸上皮，TLR9在宮頸癌中的表達(dá)明顯增加，但具體作用還不清楚。本研究旨在通過檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞TLR9的表達(dá)，并探索TLR9特異性結(jié)合配體CpG-ODN對(duì)Hela細(xì)胞TLR9表達(dá)及抗凋亡能力的影響，以探討TLR9信號(hào)通路對(duì)宮頸癌細(xì)胞抗凋亡能力的影響，為宮頸癌的免疫治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料來源宮頸癌Hela細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供；DMEM(高糖型)培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購(gòu)自Hyclone公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，均購(gòu)自Sigma公司；Trizol reagent購(gòu)自Invitrogin公司；RT試劑盒、PCR試劑盒均購(gòu)自Fermentas公司；Recombinant Human TRAIL/Apo2L購(gòu)自PEPROTECH公司；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；CpG-ODN(5’-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3’)由上海生工生物公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Hela細(xì)胞采用常規(guī)DMEM培養(yǎng)液加10%的胎牛血清，于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫密閉細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)Hela細(xì)胞中TLR9的表達(dá)取生長(zhǎng)良好，鋪滿瓶底約80%的細(xì)胞消化傳代，以每孔105個(gè)細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)過夜，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組加入CpG-ODN(終濃度5.0 μM)，對(duì)照組加入等體積PBS溶液；24 h后加入Trizol試劑提取總RNA，20 μL體系逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。TLR9引物：上游引物5’-GTGCCTTCCTACCCTGTGAG-3’，下游引物5’-AGTTGCCGTCCATGAATAGC-3’；內(nèi)參照物采用β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，上游引物5’-TCACCAACTGGGACGACAT-3’，下游引物5’-GCACAGCCTGGATAGCAAC-3’。退火溫度TLR9為55℃，β-actin為52℃，反應(yīng)循環(huán)數(shù)TLR9為40個(gè)循環(huán)，β-actin為35個(gè)循環(huán)。電泳結(jié)果：TLR9擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為342 bp，β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為173 bp。通過凝膠成像分析軟件測(cè)得TLR9 mRNA的表達(dá)，分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶吸光度值(A)之比，進(jìn)行半定量分析，以TLR9/β-actin灰度值作為其mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算均值。

1.2.3用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力每孔104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200 μL。在培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中生長(zhǎng)24 h貼壁后，更新培養(yǎng)液并加入TRAIL蛋白液使終濃度為10、20、50、100、200、500 ng/mL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)對(duì)照組(同體積的PBS)；加藥后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中作用24 h。每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，離心棄上清后，每孔加150 μL DMSO，選擇570 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(A)。6個(gè)復(fù)孔取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

1.2.4流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡取生長(zhǎng)良好，鋪滿瓶底約80%的細(xì)胞消化傳代，以每孔106個(gè)細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)過夜，隨機(jī)分為TRAIL+CpG-ODN組，TRAIL組，PBS對(duì)照組。其中TRAIL+CpG-ODN組提前添加CpG-ODN(5.0 μM)預(yù)刺激12 h，TRAIL組均加入TRAIL溶液，終濃度為200 ng/mL，對(duì)照組加入等體積PBS溶液；每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，24 h后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率。棄去各組細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗1次；用胰酶消化，加入含10%血清培養(yǎng)液終止消化；離心，1000 rpm×10 min，棄上清，加入1 mL預(yù)冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸??；離心，1000 rpm×10 min，棄上清，將細(xì)胞重懸于200 μL Binding Buffer；加入10 μL Annexin V-FITC輕輕搖勻，避光室溫反應(yīng)15 min；加入300 μL Binding Buffer(總反應(yīng)體積500 μL)以及5 μL PI，使用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,Fullerton,USA)檢測(cè)；利用CellQuest Pro軟件分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算均值。

2結(jié)果

2.1CpG-ODN刺激后宮頸癌Hela細(xì)胞中TLR9 mRNA表達(dá)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組均有TLR9表達(dá)，其中對(duì)照組TLR9 mRNA相對(duì)灰度值為0.672±0.095，而實(shí)驗(yàn)組(CpG-ODN組)TLR9 mRNA相對(duì)灰度值為0.845±0.102，明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

2.2TRAIL對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響MTT比色法測(cè)定結(jié)果顯示，不同濃度的TRAIL對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用，隨著TRAIL濃度增加，對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷抑制作用逐漸增加，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。并且計(jì)算IC50(223.092±3.850) ng/mL,下面實(shí)驗(yàn)均選用接近IC50濃度(200 ng/mL)作為實(shí)驗(yàn)濃度。詳見表2、圖2。

2.3CpG-ODN對(duì)Hela細(xì)胞對(duì)抗TRAIL誘導(dǎo)凋亡能力的影響流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示未加CpG-ODN預(yù)刺激的Hela細(xì)胞，TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率[(43.49±2.04)%]較高；TRAIL+CpG-ODN組凋亡率[(15.32±2.46)%]與TRAIL組比較明顯下降(P<0.05)。

3討論

3.1TLR9及其作用Toll樣受體屬于模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)，參與微生物病原相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)識(shí)別，在天然免疫中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。TLR9是該家族重要成員，定位于人染色體3p21.3上[1]。配體為細(xì)菌及病毒DNA中含非甲基化CpG基序和人工合成的寡氧核苷酸CpG基序[2]。TLR9信號(hào)通路屬于MyD88依賴性信號(hào)傳導(dǎo)通路，TLR9與CpG-ODN直接結(jié)合，同時(shí)募集MyD88，開始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。最終活化AP-1、NF-κB及IRF，導(dǎo)致內(nèi)皮黏附分子、炎癥因子、干擾素及共刺激分子表達(dá)，在機(jī)體免疫、細(xì)胞凋亡、抗感染性等過程中發(fā)揮重要作用[3]。

3.2TLR9在宮頸癌Hela細(xì)胞中表達(dá)近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)TLR9在多種婦科腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，如乳腺癌[4]、卵巢癌[5]、宮頸癌[6]。Lee等[7]研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常宮頸上皮，TLR9在宮頸癌中的表達(dá)明顯增加。提示TLR9在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，但具體作用機(jī)制還不清楚。

本次實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用半定量RT-PCR方法檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞株是否有TLR9的表達(dá)，同時(shí)使用TLR9特異激動(dòng)劑CpG-ODN作用于Hela細(xì)胞后TLR9 mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組Hela細(xì)胞均有TLR9表達(dá)，且CpG-ODN實(shí)驗(yàn)較對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與Jiang等[8]的TLR9在肺癌裸鼠模型中的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果一方面證實(shí)Hela細(xì)胞中有TLR9表達(dá)，另一方面說明CpG-ODN作為TLR9的特異性激動(dòng)劑通過上調(diào)TLR9轉(zhuǎn)錄進(jìn)而活化TLR9通路，發(fā)揮免疫效應(yīng)。

3.3TRAIL蛋白誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)或稱凋亡素2配體(Apo2 ligand, Apo2L)是TNF家族的新成員。Wajant等[9]用TRAIL刺激Hela細(xì)胞后均可誘發(fā)細(xì)胞凋亡。本次研究采用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRAIL可抑制Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，并且生長(zhǎng)抑制率隨藥物濃度增加而增加,與李民華等[10]研究結(jié)果相近。

3.4TLR9信號(hào)通路增強(qiáng)Hela細(xì)胞抗凋亡耐受能力本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞中表達(dá)TLR9,進(jìn)而研究TLR9是否可以增加Hela細(xì)胞系耐受TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CpG-ODN實(shí)驗(yàn)組凋亡率較PBS對(duì)照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明TLR9信號(hào)通路激活可加強(qiáng)Hela細(xì)胞抗凋亡耐受能力。

Ilvesaro等[11]檢測(cè)人類前列腺癌PC-3細(xì)胞系及臨床前列腺癌組織中均有TLR9表達(dá)，使用TLR9激動(dòng)劑細(xì)菌DNA和CpG-ODN刺激TLR9表達(dá)陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)可以通過上調(diào)MMP-13增加癌細(xì)胞的侵襲力。而TLR9的配體不能增加無TLR9表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞MDA-Pca2b的侵襲力。Di等[12]研究發(fā)現(xiàn)，以TLR9的特異性配體CpG-ODN刺激肺癌A549細(xì)胞系，可以使腫瘤細(xì)胞對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗作用。因此，我們認(rèn)為腫瘤細(xì)胞上的TLRs是有利于腫瘤細(xì)胞生存的。

本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)TLR9激動(dòng)劑CpG-ODN可以增強(qiáng)Hela細(xì)胞抗凋亡能力。TLR9的特異性配體CpG-ODN所致Hela細(xì)胞的抗凋亡能力，通過活化TLR9信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的，但其具體的分子機(jī)制仍待今后進(jìn)一步的研究確定。相信隨著對(duì)模式識(shí)別受體TLR(Toll-like receptor)的生物學(xué)特性和功能的深入研究，TLR在機(jī)體免疫調(diào)控及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和地位越來越明顯，將為尋找腫瘤免疫治療提供新思路。

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[11]Ilvesaro JM,Merrell MA,Swain TM,et al.Toll like receptor-9 agonists stimulate prostate cancer invasion in vitro[J].The Prostate,2007,67:774-781.

[12]Di JM, Zhou J, Zhou XL, et al.Cyclooxygenase-2 expression is associated with vascular endothelial growth factor-C and lymph node metastases in human prostate cancer[J].Arch Med Res,2009,4(10):268-275.

(2015-01-08收稿2015-02-21修回)

讀者·作者·編者

2015年《安徽醫(yī)學(xué)》審稿專家座談會(huì)在肥召開

為加強(qiáng)交流，集思廣益，不斷推進(jìn)期刊的健康發(fā)展，《安徽醫(yī)學(xué)》編輯部于2015年4月9日在合肥召開了部分編委及審稿專家座談會(huì)。31位長(zhǎng)期熱情支持《安徽醫(yī)學(xué)》期刊發(fā)展的編委、審稿專家參加座談。省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所曹迎慶副所長(zhǎng)、情報(bào)研究室胡欣副主任及編輯部全體人員到會(huì)聽取專家意見。

會(huì)議由胡欣副主任主持，編輯部張迪同志向大家匯報(bào)了2014年編輯部的工作情況，蔡剛同志為各位專家介紹了新上線的“《安徽醫(yī)學(xué)》期刊在線編審系統(tǒng)”，并演示了在線投稿、編審等各項(xiàng)功能操作流程。之后，專家們?cè)诔浞挚隙ā栋不蔗t(yī)學(xué)》近年來取得矚目成績(jī)的基礎(chǔ)上，圍繞期刊今后發(fā)展目標(biāo)和任務(wù)積極建言獻(xiàn)策，并就審稿方式、如何組織和刊發(fā)高質(zhì)量稿件、不斷提高期刊質(zhì)量等議題提出了很好的意見和建議。

曹迎慶副所長(zhǎng)代表編輯部感謝專家們長(zhǎng)期以來對(duì)《安徽醫(yī)學(xué)》期刊的關(guān)心和支持，表示將根據(jù)專家們的意見和建議制定相應(yīng)的工作計(jì)劃，不斷加強(qiáng)與專家們的溝通與交流，努力學(xué)習(xí)先進(jìn)，改進(jìn)不足，不斷提高期刊的學(xué)術(shù)水平和編輯質(zhì)量，與大家共同努力，積極推進(jìn)《安徽醫(yī)學(xué)》期刊的可持續(xù)發(fā)展。

《安徽醫(yī)學(xué)》編輯部

Anti-apoptosis effect of cervical cancer cell with toll-like receptor 9 signaling pathway

ChenYing,ZhouJiade

DepartmentofGynecologyandObstetrics,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei230022，China

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the expression of TLR9 in Hela cell line and the influence of TLR9 signaling pathway on apoptosis resistance of cervical cancer cell line Hela, in order to find a new approach of immunotherapy for cervical cancer. MethodsCervical cancer Hela cell line was cultured in vitro. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to evaluate the expression level of TLR9 mRNA in Hela cells. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)assay was used to detect the inhibition rate of cell proliferation of Hela cells which was plused with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) protein at different concentrations. Flow cytometry(FCM) was used to measure the rate of apoptosis cell induced by TRAIL protein. Results①The TLR9 mRNA was detected in cervical cancer Hela cell line. And the expression level of TLR9 mRNA of Hela cells incubated with TLR9 agonistic CpG-ODN was significantly higher than that in normal controls(P<0.05).②The cell proliferation of Hela cell was inhibited by TRAIL protein and the half maximal inhibitory concentration of TRAIL protein was (223.092±3.850) ng/ml.③The percentage of apoptotic Hela cells treated with CpG-ODN was (15.32±2.46)%, which decreased markedly than the control group(43.49±2.04)% without the treatment of CpG-ODN(P<0.05). ConclusionTLR9 agonistic ligand CpG-ODN induces the resistance of Hela cells to TRAIL-induced apoptosis, which suggests TLR9 signaling plays an important role in tumor progression and leads to novel immunotherapy against cervical cancer.

[Key words]Cervical cancer; Hela cells; Toll-like receptor 9; Cell apoptosis; CpG-ODN

通信作者：周家德，zhjiade@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1000-0399.2015.04.004