金　華，丁家怡，邵　駿

(南通市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南通 226000)

不同來源精子在ICSI中對受精、胚胎發(fā)育的影響

金華，丁家怡※，邵駿

(南通市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇 南通 226000)

摘要：目的探討不同來源精子在卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)中對受精、胚胎發(fā)育的影響。方法選擇2012年1月至2014年12月南通市婦幼保健院收治的180例因單純男性因素行ICSI助孕治療的患者為研究對象，按照患者受孕精子的不同來源分為射精組、睪丸穿刺取精術(shù)(TESA)組和經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)(PESA)組，各60例。比較三組患者受精率及胚胎發(fā)育情況。結(jié)果射精組、TESA組和PESA組患者的正常受精率分別為64.8%(467/721)、61.7%(441/715)和76.5%(555/726)，PESA組患者的正常受精率高于射精組和TESA組(P<0.05)，而三組患者的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率以及胚胎種植率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論不同來源的精子對ICSI中受精率影響不同，但對胚胎發(fā)育質(zhì)量無顯著影響，其中，PESA來源的精子正常受精率較高，胚胎發(fā)育良好，可作為梗阻性無精癥臨床治療的有效方法。

關(guān)鍵詞：卵胞漿內(nèi)單精子注射；睪丸穿刺取精；經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)；受精；胚胎發(fā)育

不育不孕癥是生殖醫(yī)學(xué)常見病之一，據(jù)統(tǒng)計其發(fā)病率在育齡夫婦中占8%～10%，且呈不斷升高趨勢，其中男性因素占30%～50%[1-2]。男方因素主要包括無精子癥、精子數(shù)量和質(zhì)量異常、性功能障礙及射精障礙等，對于無精子癥和重度少弱畸精子癥患者，治療的唯一方案就是供精。卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技術(shù)自1992年報道以來成為男性不育治療的重要手段，已成為目前治療無精子癥和精液異常的最有效方法[3-4]。ICSI避開了常規(guī)受精過程中精子獲能、頂體反應(yīng)、識別、黏附、融合等步驟，經(jīng)顯微操作將精子直接注入到卵細胞胞質(zhì)內(nèi)完成體外受精，降低了常規(guī)輔助受精對精子質(zhì)量和數(shù)量的要求，極大提高了受孕的可能性。研究人員采用睪丸穿刺取精(testicular sperm retrieval puncture,TESA)和經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)(percutaneous epididymal sperm retrieval,PESA)獲取患者精子并結(jié)合ICSI在治療梗阻性或非梗阻性無精子不育癥中獲得巨大成功[5]。但是，國內(nèi)外研究人員對不同來源的精子在ICSI中受精率、卵裂率、胚胎發(fā)育情況及妊娠結(jié)局報道不一，爭議較大[6-7]。本研究主要探討不同來源精子在ICSI中對受精、胚胎發(fā)育的影響，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2012年1月至2014年12月南通市婦幼保健院收治的180例因單純男性因素行ICSI助孕治療的患者為研究對象，患者均符合世界衛(wèi)生組織精子實驗室診斷和處理手冊第5版診斷標準[8]中的男性不育因素。按照患者受孕精子的不同來源分為射精組、TESA組和PESA組，各60例。其中，TESA組為梗阻性無精子患者和非梗阻性無精子癥患者，PESA組為梗阻性無精子患者。

1.2納入標準 ①女性年齡<40歲，不孕年限≤15年，基礎(chǔ)激素水平在正常范圍，月經(jīng)周期規(guī)律，并排除子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位等癥；②單純男性因素(梗阻性無精癥、隱匿性無精癥、嚴重少弱畸精癥)，染色體核型正常；③均為第一次促性腺激素釋放激素激動劑長方案控制性卵巢刺激周期。

1.3控制性刺激排卵方案采取黃體中期性腺激素釋放激素拮抗劑長方案進行控制下卵巢刺激周期，降調(diào)超過14 d時對女方激素水平、竇狀卵泡直徑及子宮內(nèi)膜厚度進行測定，待卵泡刺激素<5 U/L、促黃體生成素≤5 U/L、雌二醇≤50 μg/L、竇狀卵泡直徑<8 mm、內(nèi)膜厚度≤5 mm后應(yīng)用促性腺激素150～300 U啟動控制下卵巢刺激周期，并對患者血清雌二醇和促黃體生成素水平及卵泡情況進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果合理調(diào)整促卵泡激素用量。當(dāng)直徑達到18 mm的主導(dǎo)卵泡超過3個時肌內(nèi)注射4000～10 000 U人絨毛膜促性腺激素(北京泰格科信生物科技有限公司生產(chǎn)，批號：20111024)，36 h后經(jīng)B超引導(dǎo)取出卵細胞。

1.4精子的獲取及處理方法射精組：取精前，患者禁欲 3～7 d，采取手淫方式留取精液標本，利用密度梯度離心法對精液進行處理，備檢。TESA組：患者仰臥，對陰囊部位進行常規(guī)消毒，選擇穿刺點，在使用2%利多卡因局部麻醉后采用含有2 mL精子培養(yǎng)液(SAGE,USA)的5 mL注射器行睪丸穿刺取精，負壓下抽取出睪丸組織，體視鏡下將曲精細管切碎，混勻后常規(guī)離心沉淀，備檢。PESA組：患者仰臥，對陰囊部位進行常規(guī)消毒，選擇穿刺點，在使用2%利多卡因局部麻醉后采用含有1 mL精子培養(yǎng)液(SAGE,USA)的5 mL注射器行經(jīng)皮附睪穿刺取精，抽取淡黃色附睪液，混勻后離心沉淀，備檢。

1.5ICSI治療在取卵2～4 h后將卵丘顆粒細胞除去，選擇M2期卵細胞和形態(tài)正常、活力較好的精子進行ICSI治療。對胚胎發(fā)育進行動態(tài)觀察并在取卵后第3日根據(jù)胚胎發(fā)育速度、卵裂球大小形狀、無核碎片量及分布等情況進行評級，分為1、1.5、2、2.5、3、3.5、4共7個級別，其中1～2級為優(yōu)質(zhì)胚胎，1～3級為可移植胚胎。

取卵后第3日行胚胎移植，給予地屈孕酮片、黃體酮等黃體支持，胚胎移植半個月左右對患者尿人絨毛膜促性腺激素進行檢測，陽性患者為生化妊娠。移植后35 d對患者進行B超檢查，發(fā)現(xiàn)孕囊及胚芽者為臨床妊娠。

1.6觀察項目

1.6.1受精、卵裂及胚胎質(zhì)量觀察卵子在ICSI后16～18 h觀察有無原核形成，正常受精為雙原核(2PN)；在受精后第3日觀察胚胎卵裂情況，記錄卵裂球數(shù)目；根據(jù)卵裂球的均勻程度、大小及無核碎片的量對胚胎質(zhì)量進行評價，根據(jù) Peter 卵裂期胚胎評分標準[9]，胚胎培養(yǎng)3 d后細胞數(shù)為7～8個，核碎片評級為Ⅰ～Ⅱ級的胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

1.6.2胚胎移植及妊娠的觀察取第3日的胚胎進行新鮮周期胚胎移植，14 d后檢測女方血人絨毛膜促性腺激素水平，觀察是否受孕；30 d后超聲檢查觀察女方宮腔內(nèi)是否存在孕囊，并結(jié)合心管脈搏確定女方是否妊娠。

2結(jié)果

2.1三組患者一般資料比較3組患者的年齡、不孕年限、基礎(chǔ)卵泡刺激素及人絨毛膜促性腺激素日雌二醇值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2三組患者受精及胚胎發(fā)育情況比較射精組、TESA組和PESA組的正常受精率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中PESA組患者的正常受精率高于射精組和TESA組(χ2=23.769，36.807，P<0.05)；三組患者的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率以及胚胎種植率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表1　三組因單純男性因素行卵胞漿內(nèi)單精子注射助孕治療患者的一般資料比較　±s)

TESA:睪丸穿刺取精術(shù)；PESA；經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)

表2　三組因單純男性因素行卵胞漿內(nèi)單精子注射助孕治療患者的受精及胚胎發(fā)育情況比較　(n=60,%)

TESA:睪丸穿刺取精術(shù)；PESA；經(jīng)皮附睪穿刺取精術(shù)；a與PESA組比較，P<0.05

3討論

ICSI是將單個精子在體外直接注入卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)使精子與卵細胞結(jié)合形成受精卵，從而有效治療部分不孕不育疾病，特別是男性不育患者，如梗阻性無精癥、重度少弱畸精子癥等，臨床療效顯著[10]。ICSI不僅能采用密度低、活力差的射出精子，還能采用附睪、睪丸中的精子及經(jīng)冷凍復(fù)蘇后的精子，均能使卵母細胞受精并最終發(fā)育成胚胎[11]。ICSI用于治療男方因素導(dǎo)致的不孕不育已獲得很大成功，該技術(shù)可以利用射出的精子、睪丸中的精子及附睪中的精子使成熟卵母細胞正常受精并形成優(yōu)質(zhì)胚胎，獲得臨床妊娠及分娩，但是不同來源的精子對于ICSI過程中卵母細胞的受精及胚胎的發(fā)育影響目前臨床報道尚不一致。首先，可以肯定的是精子的質(zhì)量會嚴重影響卵母細胞體外受精率，不同來源的精子由于其形態(tài)、成熟度及質(zhì)量上的差異會影響其與卵母細胞的結(jié)合，從而影響受精。研究表明[12]，來源于附睪的精子行ICSI治療后正常受精率明顯高于睪丸的精子，說明受精率與精子成熟度有關(guān)，睪丸中的精子生成后在附睪內(nèi)經(jīng)過精核的成熟、精子質(zhì)膜的通透性改變和頂體外膜抗原分布的改變等進一步成熟后具有更強的運動能力和受精能力，更加有利于與卵母細胞結(jié)合而受精。本研究中，射精組、TESA組和PESA組患者的正常受精率分別為64.8%、61.7%和76.5%，PESA組患者的正常受精率高于射精組和TESA組(P<0.05)。PESA組患者的正常受精率較射精組高的原因是射精組隱匿性精子癥和嚴重少弱畸精子癥多由于睪丸生精功能障礙或低下導(dǎo)致精子數(shù)量較少，畸形率較高，而PESA組患者僅包括梗阻性精子癥患者，這些患者生精功能正常，精子數(shù)量較高，不影響受精過程。

卵細胞受精后的卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率是反映胚胎質(zhì)量的重要指標，從4～8細胞階段受精卵mRNA即開始轉(zhuǎn)錄，父方

基因開始表達，本身存在缺陷的精子對于父方基因的表達將產(chǎn)生影響，導(dǎo)致4～8細胞階段的胚胎發(fā)育緩滯。一般情況下，受精后第3日的胚胎處于6～8細胞期或早期致密化，因此，受精后第3日卵裂數(shù)為7～8個的Ⅰ、Ⅱ級胚胎屬于優(yōu)質(zhì)胚胎，發(fā)育潛能較好。

胚胎種植率及妊娠率是反映移植胚胎在體內(nèi)發(fā)育潛能的重要指標，有研究稱，精子的來源對ICSI治療的胚胎種植率及妊娠率無明顯影響[13]。本研究中，不同來源精子受精后得到的胚胎的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率以及妊娠率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其原因可能是受精完成后，胚胎的發(fā)育與精子無關(guān)[14]。

綜上所述，ICSI治療可應(yīng)用不同來源的精子，不同來源的精子對ICSI中受精率影響不同，PESA來源的精子正常受精率較高。同時，不同來源的精子對于胚胎的發(fā)育，包括卵母細胞受精后的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率及妊娠率均無顯著影響。因此，PESA聯(lián)合ICSI對于梗阻性無精子癥、不射精癥、死精子癥、輸精管缺失以及性功能障礙等男性因素導(dǎo)致不育癥的治療，可獲得較高的受精率和妊娠率，促進胚胎的健康發(fā)育具有重要意義。

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The Comparative Study of Effect of Spermatozoa from Different Sources on Normal Fertilization and Embryo Development in Intracytoplasmic Sperm Injection Cycles

JINHua，DINGJia-yi,SHAOJun.

(DepartmentofCenterforReproductiveMedicine,NantongCityMaternalandChildHealthHospital,Nantong226000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate effect of spermatozoa from different sources on normal fertilization and embryo development in intracytoplasmic sperm injection(ICSI) cycles.MethodsA total of 180 cases of male factor alone for ICSI progesterone therapy in Nantong City Maternal and Child Health Hospital from Jan.2012 to Dec.2014 selected for the study were divided into ejaculated spermatozoa group,testicular sperm aspiration(TESA) group and percutaneous epididymal sperm aspiration(PESA) group according to different sources,each of 60 cases.Fertilization rate and embryo development of the three groups were compared.ResultsThe normal fertilization rate of ejaculated spermatozoa group,TESA group and PESA group were 64.8%(467/721)，61.7%(441/715) and 76.5%(555/726),and the normal fertilization rate of PESA group was significantly higher the other two groups(P<0.05).The cleavage rate,high-quality embryo rate,pregnancy rate and implantation rate had no statistically significant difference(P>0.05).ConclusionThe normal fertilization rate of spermatozoa from different sources are diffreent,but the quality of the embryo has no significant effect,and the spermatozoa obtained by PESA has a higher rate of normal fertilization and high-quality embryo,which is an effective clinical treatment method for obstructive azoospermia.

Key words:Intracytoplasmic sperm injection; Testicular sperm aspiration; Percutaneous epididymal sperm aspiration; Fertilization; Embryo development

收稿日期：2015-06-24修回日期：2015-08-17編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.063

中圖分類號：R714

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4392-03