陳 歷，石秋艷，張春陽，孫 原，李艷玲，楊 斌

近年來，隨著缺血預適應方法的研究深入，發(fā)現(xiàn)由于疾病的不可預測性，缺血預適應難以應用在臨床［1］。近幾年研究表明，肢體缺血后處理對腦梗死也有保護作用。通過無創(chuàng)性的短暫缺血過程，誘導組織產(chǎn)生內(nèi)源性的保護機制，能夠減輕缺血再灌注損傷，為人們對缺血防治的認識開辟了新的領(lǐng)域，如何啟動、激活這種內(nèi)源性保護的研究具有積極的現(xiàn)實和理論意義。本實驗旨在探討肢體缺血后處理對大鼠急性腦梗死后血腦屏障的保護效應及其機制，從而為臨床應用提供理論研究和實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組 SD 雄性大鼠196 只，體重200～250 g，來源于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究生動物實驗中心［許可證號:SCXK-(軍)2009-003］，恒溫(26 ℃)安靜環(huán)境中飼養(yǎng)。術(shù)前3 只一籠飼養(yǎng)，自由飲水進食，適應飼養(yǎng)環(huán)境至少7 d 后方接受實驗，術(shù)后單籠飼養(yǎng)。術(shù)前12 h 禁食，自由飲水。實驗前采用抽簽法隨機分為7 組，每組28 只:(1)假手術(shù)組;(2)缺血再灌注24 h 組;(3)肢體缺血后處理24 h 組;(4)缺血再灌注72 h 組;(5)肢體缺血后處理72 h 組;(6)缺血再灌注5 d 組;(7)肢體缺血后處理5 d 組。

1.2 實驗主要試劑 β-淀粉樣蛋白(Aβ)抗體、EphA2 鼠抗人單克隆抗體、伊文思藍(EB)(均購于石家莊市勃盛化學試劑有限公司)。

1.3 大腦中動脈缺血模型［2］參照并改良Zea-Longa 線栓法制備大鼠右側(cè)MCAO 模型。術(shù)后用墊料蓋于大鼠身上，保持體溫至清醒。術(shù)中維持肛溫在37 ℃左右。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進食。排除標準:抽拉線栓后2 h 昏迷;Zea Longa評分0 分或者4 分;腦出血;死亡。

1.4 Zea Longa 評分標準 0 分:無明顯神經(jīng)缺損癥狀;1 分:提尾垂直時不能伸展左側(cè)前肢;2分:行走時向左側(cè)繞圈;3 分:行走時身體向左側(cè)傾倒4 分;不能自行行走，意識喪失。

1.5 肢體缺血后處理方法 暴露雙側(cè)股動脈主干，在MCAO 后2 h 及以后每天同一時間用動脈夾給予夾閉2 min，開放2 min，雙側(cè)股動脈輪流進行，各5 個循環(huán)，連續(xù)5 d。假手術(shù)組和缺血再灌注組暴露股動脈(由非手術(shù)人員隨機分組)。每天實驗完后用慶大霉素局部消炎。

1.6 右側(cè)腦組織含水量［3］大鼠麻醉后斷頭取腦，去除小腦、腦干及嗅球，電子分析天平稱取腦濕重，置于70 ℃烤箱中烘72 h 稱取腦干重，按公式:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重，計算出腦組織的含水量。

1.7 伊文思藍的含量［4］各組在再灌注開始時即從股靜脈注射2%伊文思藍(evans blue，EB)溶液(4 ml/kg)，酶標儀法檢測倍比稀釋后的EB 溶液，繪制標準曲線，然后根據(jù)標準曲線求得EB 含量(μg/g 腦組織)。

1.8 免疫組化法檢測EphA2 和Aβ 的表達 結(jié)果判定及計數(shù):EphA2 和Aβ 均以胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性細胞，每張切片計數(shù)5 個不同400倍視野下陽性細胞數(shù)，作為各指標的陽性細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用單因素方差分析，結(jié)果用均數(shù)±標準差()表示，應用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析，P ＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量比較 與假手術(shù)組比較，再灌注和肢體缺血后處理各時間右側(cè)腦組織含水量均較高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。再灌注組24 h右側(cè)腦組織含水量開始升高，72 h 達高峰，5 d出現(xiàn)下降;肢體缺血后處理也有相同趨勢的變化，肢體缺血后處理24 h 與再灌注組同一時間略低，差異無統(tǒng)計學意義，72 h、5 d 肢體缺血后處理右側(cè)腦組織含水量均低于再灌注組同一時間，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(見表1)。

2.2 右側(cè)腦組織EB 含量比較 假手術(shù)組大鼠右側(cè)腦組織含有少量EB，再灌注和肢體缺血后處理各時間組均比假手術(shù)組右側(cè)腦組織EB 含量高，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。肢體缺血后處理24 h與再灌注組同一時間比較降低不明顯，再灌注72 h、5 d 組右側(cè)腦組織EB 含量明顯高于肢體缺血后處理組同一時間，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(見表2)。

2.3 EphA2 表達的比較 EphA2 陽性表達為神經(jīng)元胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。再灌注和肢體缺血后處理各時間組大鼠腦梗死周圍區(qū)域的EphA2的陽性細胞數(shù)均比假手術(shù)組顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。再灌注組24 h 組EphA2 增多，72 h 達高峰，5 d 出現(xiàn)下降;肢體缺血后處理變化趨勢相同，與再灌注組同一時間比較，肢體缺血后處理72 h、5 d 組EphA2 的陽性細胞數(shù)均較低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(見表3、圖1)。

2.4 Aβ 表達的比較 Aβ 陽性表達為神經(jīng)元胞漿及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。再灌注和肢體缺血后處理各時間組大鼠腦梗死周圍區(qū)域的Aβ 的陽性細胞數(shù)均比假手術(shù)組顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。再灌注組Aβ 隨時間不斷增多，5 d 開始下降;肢體缺血后處理變化趨勢相同;肢體缺血后處理24h 組與再灌注組同一時間比較，Aβ 的陽性細胞數(shù)差異不明顯(P ＞0.05);再灌注72 h、5 d 組Aβ的陽性細胞數(shù)明顯高于肢體缺血后處理同時間組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(見表4、圖2)。

表1 各組不同時間點大鼠右側(cè)腦組織含水量比較(%，，n=7)

表1 各組不同時間點大鼠右側(cè)腦組織含水量比較(%，，n=7)

與假手術(shù)組相比較* P ＜0.05;與相應時間點再灌注組相比較#P ＜0.05

表2 各組不同時間點大鼠右側(cè)腦組織EB 含量比較(μg/g，，n=7)

表2 各組不同時間點大鼠右側(cè)腦組織EB 含量比較(μg/g，，n=7)

與假手術(shù)組相比較* P ＜0.05;與相應時間點再灌注組相比較#P ＜0.05

表3 各組不同時間點腦梗死周圍區(qū)域EphA2 陽性細胞數(shù)比較(個/視野，，n=7)

表3 各組不同時間點腦梗死周圍區(qū)域EphA2 陽性細胞數(shù)比較(個/視野，，n=7)

與假手術(shù)組相比較* P ＜0.05;與相應時間點再灌注組相比較#P ＜0.05

表4 各組大鼠大鼠腦梗死周圍區(qū)域Aβ 陽性細胞數(shù)比較(個/視野，，n=7)

表4 各組大鼠大鼠腦梗死周圍區(qū)域Aβ 陽性細胞數(shù)比較(個/視野，，n=7)

與假手術(shù)組相比較* P ＜0.05;與相應時間點再灌注組相比較#P ＜0.05

3 討論

2009 年Ren 等［5］研究表明左側(cè)股動脈實施缺血后處理能夠有效地縮小大鼠腦梗死體積，并且能促進遠期神經(jīng)功能恢復。肢體缺血后處理通過腦缺血耐受而調(diào)動內(nèi)源性保護機制，提高神經(jīng)元對缺血的耐受性，延長缺血性腦血管病的治療時間窗，為缺血性腦血管病的防治提供新的思路［6］。肢體缺血后處理可在腦缺血事件發(fā)生后實施，操作方法簡單，對人體的損傷微小［7］，具有重要的臨床應用價值，尤其在急性腦梗死早期實施溶栓治療或經(jīng)皮血管內(nèi)介入治療時，適時予以腦缺血后適應干預，可有效地贏得溶栓時間窗、減輕缺血再灌注損傷程度，為急性腦梗死的臨床治療提供新的策略。但是遠端肢體缺血后處理的開始時間、持續(xù)時間、循環(huán)次數(shù)等因素對缺血后處理腦保護的影響，不同的研究間存在爭議。Ren等研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后實施3 個循環(huán)的缺血后處理，即刻后處理的保護效果明顯優(yōu)于3 h 后處理組和6 h 后處理組。CE 等［8］研究顯示，肢體缺血時間累計持續(xù)40～60 min 能發(fā)揮最大的保護效應。為了進一步驗證肢體缺血后處理有腦保護作用，同時增加操作可行性，本研究采用輪流夾閉雙下肢股動脈主干，2 min 缺血/2 min 再灌注，各5 個周期，連續(xù)5 d。通過測量不同組別的腦含水量及EB 的通透性發(fā)現(xiàn)，與單純再灌注比較，肢體缺血后處理顯著地減少了大鼠腦梗死后血腦屏障通透性，從客觀上證明了肢體缺血后處理對腦梗死有保護效應。

我們通過免疫組化染色觀察到，假手術(shù)組有少量EphA2 表達，說明了正常機體含有少量EphA2 可能與維持正常的中樞神經(jīng)功能的有關(guān)。MCAO 術(shù)后24 h，單純再灌注和肢體缺血后處理EphA2 均明顯開始升高，72 h 達高峰，5 d 開始下降;但是與再灌注組同一時間比較，肢體缺血后處理24 h 組EphA2 的陽性細胞數(shù)差異不明顯，肢體缺血后處理72 h 及5 d組EphA2 的陽性細胞數(shù)均明顯較低。說明了腦梗死后EphA2 表達不斷增多，過多的EphA2 對機體產(chǎn)生毒害作用;當肢體缺血后處理累計時間未達到閾值時，產(chǎn)生的保護效應不明顯，當達到閾值后，肢體缺血后處理的保護效應才能體現(xiàn)出來。與以往的研究一致［9］，腦梗死后EphA2 表達的增高導致血腦屏障通透性增高，可能是由于被大量激活的EphA2 上調(diào)EphrinA1 配體和EphrinA3 配體，通過一系列信號傳遞，破壞血腦屏障緊密連接的形成，增加大腦內(nèi)皮細胞通透性，并且抑制神經(jīng)元再生，促進細胞凋亡［10］。但是，有實驗證明［11］，慢性壓迫性脊髓損傷后由于缺血、缺氧引起VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)上調(diào)，可活化EphA2，從而出現(xiàn)血管新生及微血管改型，增加了局部血液循環(huán)，間接保護了神經(jīng)細胞，保存了神經(jīng)功能。EphA2 在急性缺血和慢性缺血中截然相反的作用讓我們看到EphA2 作用的多樣性，目前我們對它的研究還不夠完善，需要我們更多的研究。

β-淀粉樣蛋白增多會導致阿爾茨海默病的發(fā)生已得到公認［12～14］。但是許多研究表明，腦缺血后Aβ 也增多，主要在腦白質(zhì)以及灰質(zhì)缺血區(qū)周邊，可有數(shù)日到數(shù)周的短暫性升高［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在MCAO 術(shù)后24 h 開始升高，72 h 達高峰，5 d 開始下降;這與EphA2、右側(cè)腦組織含水量及EB 含量的升高趨勢大致相同，可以推測Aβ 的升高與EphA2增加血腦屏障的通透性有關(guān)系，可能由于血腦屏障的通透性的增加導致了外源性Aβ 的增多，導致β淀粉樣蛋白在腦內(nèi)異常增多，引起了缺血再灌注損傷。而經(jīng)過肢體缺血后處理，72 h 及5 d 組EphA2的陽性細胞數(shù)均明顯較低。說明肢體缺血后處理能夠減少對血腦屏障的通透性，從而減少了Aβ 的數(shù)量。由此還可推測，肢體缺血后處理能夠通過減少Aβ，從而防治淀粉樣血管病和阿爾茨海默病的發(fā)生。但是，由于本實驗為動物實驗，且樣本量較小，尚需大樣本的實驗及臨床研究證實。

圖1 MCAO 后72 h 腦梗死周圍區(qū)域EphA2 表達情況(免疫組化，×400)

圖2 MCAO 后72 h 腦梗死周圍區(qū)域Aβ 表達情況(免疫組化，×400)

綜上所述，肢體缺血后處理能減輕大鼠急性腦梗死血腦屏障損傷的作用，腦梗死周圍區(qū)EphA2 和Aβ 表達水平的降低可能為保護血腦屏障的機制。

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