歐 軍，姚平波，蔣福生，胡 聶，劉貴香，張 平

脊髓缺血再灌注損傷是一類脊髓神經(jīng)元組織循環(huán)得到改善后乃出現(xiàn)的延遲性神經(jīng)功能障礙或不可逆性遲發(fā)性神經(jīng)元損傷［1］。目前認(rèn)為參與脊髓缺血再灌注損傷發(fā)生的機(jī)制主要有免疫機(jī)制、血管機(jī)制、自由基損傷學(xué)說、鈣介導(dǎo)機(jī)制、炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)演化機(jī)制調(diào)控其神經(jīng)元細(xì)胞的自身活化及極化狀態(tài)，也調(diào)控神經(jīng)再生和修復(fù)功能［2］。輔助性T 細(xì)胞17(T-helper17 cells，Th17)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型Th 細(xì)胞亞群，其介導(dǎo)炎性反應(yīng)，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)是能夠抑制免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，能夠下調(diào)免疫反應(yīng)［3］。Treg細(xì)胞和Th17 細(xì)胞通過細(xì)胞因子的作用相互轉(zhuǎn)換，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫抑制與免疫效應(yīng)并使之處于精細(xì)而復(fù)雜的動態(tài)平衡中［4］。Th17/Treg 保持平衡，有利于機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持，如果Th17/Treg 失平衡就會導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展乃至惡化［5～7］。但目前國內(nèi)外有關(guān)Th17/Treg 平衡在大鼠脊髓缺血再灌注損傷中的變化、意義及其調(diào)控機(jī)制的研究未見文獻(xiàn)報道。為此，筆者觀察大鼠脊髓缺血再灌注損傷Thl7/Treg的特異性轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，為闡明大鼠脊髓缺血再灌注損傷免疫紊亂的細(xì)胞與分子機(jī)制提供新思路及線索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar 大鼠40 只，體質(zhì)量(400 ±20)g(由南華大學(xué)比較醫(yī)學(xué)科提供)。購進(jìn)大鼠后進(jìn)行1 w 的適應(yīng)性飼養(yǎng)，溫度控制在20 ℃～28 ℃。隨機(jī)分為對照組(10 只)和脊髓缺血再灌注組(40 只)。

1.2 脊髓缺血再灌注損傷模型制備 采用1%氯胺酮100 mg/kg 腹腔注射麻醉，固定于實驗臺上。按昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院李艷華教授首創(chuàng)的大鼠腎下腹主動脈結(jié)扎并切斷腎上腹主動脈發(fā)出的椎動脈，制備脊髓缺血再灌注損傷模型［8］。術(shù)后靜脈緩慢推注青霉素預(yù)防感染。大鼠完全清醒后放入單籠飼養(yǎng)。所有大鼠于缺血再灌注后重新麻醉，進(jìn)行取材并-70 ℃冰箱保存。脊髓缺血再灌注損傷成功模型制作的標(biāo)準(zhǔn):大鼠蘇醒后痙攣性擺動尾巴能正常進(jìn)食，前肢功能正常，雙下肢癱瘓伴不同程度的大小便功能障礙。

1.3 轉(zhuǎn)錄因子RORγt 和Foxp3 mRNA 的表達(dá)自外周血分離淋巴細(xì)胞，Trizol 一步法提取總RNA，按照試劑盒說明書步驟反轉(zhuǎn)錄cDNA 及行熒光RT-PCR 檢測Foxp3 mRNA 和RORγt mRNA 水平表達(dá)。各基因引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度(見表1)。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算mRNA 表達(dá)量，并計算其相對表達(dá)量(β-actin 校正值)。引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.4 血清細(xì)胞因子的測定 解凍-70 ℃保存的脊髓組織，裂解組織(裂解液4 ml/g)，冰浴超聲勻漿，于4 ℃、3000 r/min 離心15 min 后收集上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測白細(xì)胞介素-17 (interleukin-17，IL-17)、IL-6 及IL-10 檢測步驟，使用全自動酶標(biāo)儀讀取波長450 nm 處的A 值。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中的IL-10、IL-6 和IL-17 的濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(χ ± s)表示，采用One-Way ANOVA 檢驗，P ＜0.05 或P ＜0.01 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA 及RORγt mRNA的表達(dá)情況 脊髓缺血再灌注后大鼠組織中的Foxp3 mRNA 的表達(dá)急劇下降，在第3 天時表達(dá)量降到最低，之后隨著時間的延長出現(xiàn)再升的趨態(tài);RORγt mRNA 表達(dá)量在第3 天時升至最高，之后隨著時間的延長出現(xiàn)再降的趨態(tài)(見表2)。

2.2 各組細(xì)胞因子之間的比較 脊髓缺血再灌注后各組IL-10 含量與對照組比較均明顯升高(P＜0.01)，在第3 天為最高。脊髓缺血再灌注后第1天其IL-6 及IL-17 含量均高于對照組(P ＜0.01)，但I(xiàn)L-10 在脊髓缺血再灌注后其動態(tài)演變呈雙相變化趨勢，即在腸缺血再灌注后第3 天和第5 天分別出現(xiàn)兩個波谷。而脊髓缺血再灌注后第3 天和第7天其IL-6 及IL-17 含量處于較高水平，與第1 天比較有顯著性差異(P ＜0.05，見表3)。

表1 各基因引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

表2 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA 及RORγt mRNA 的表達(dá)()

表3 各組之間細(xì)胞因子的比較(，ng/ml)

表3 各組之間細(xì)胞因子的比較(，ng/ml)

3 討論

Treg 細(xì)胞是一種具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)免疫耐受的T 細(xì)胞亞群。Treg 細(xì)胞的免疫抑制性是其最重要特性之一，能抑制效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞增生與活化［9，10］。Th17 細(xì)胞介導(dǎo)炎性反應(yīng)，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞保持平衡有利于機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持。Th17 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞之間穩(wěn)態(tài)的破壞是很多炎癥反應(yīng)與自身免疫性疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素［11，12］。

脊髓缺血再灌注損傷機(jī)制尚不十分明確。隨著不斷深入的研究，人們逐漸關(guān)注IL-10/IL-17 或IL-6/IL-17 軸在其發(fā)生及發(fā)展中的重要意義。本實驗研究表明，脊髓缺血再灌注損傷不同時間點的RORγt mRNA、Foxp3 mRNA 及細(xì)胞因子的表達(dá)與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05 或P ＜0.01)。這說明在脊髓缺血再灌注損傷組織中Th17細(xì)胞/Treg 細(xì)胞比例失衡，Treg 細(xì)胞下調(diào)，免疫調(diào)節(jié)功能下降，導(dǎo)致效應(yīng)性CD4+T 細(xì)胞大量活化，產(chǎn)生大量致炎因子，導(dǎo)致免疫功能紊亂，Th17 細(xì)胞數(shù)也隨之減少。Th17 細(xì)胞表達(dá)水平過低，從而導(dǎo)致機(jī)體抵抗能力下降，但Th17 細(xì)胞過度表達(dá)可能引發(fā)炎性反應(yīng)和自身免疫應(yīng)答。故適當(dāng)提高缺血再灌注損傷組織Treg 的水平，將有助于改善其免疫功能。

此外隨著脊髓缺血再灌注損傷的發(fā)生及發(fā)展，其機(jī)體細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的動態(tài)演變?nèi)绾?，也是本實驗深入研究的方向和?nèi)容，以期全面系統(tǒng)地觀察Th17、Treg 及其上游調(diào)控因子與脊髓缺血再灌注損傷病程的相關(guān)性。在本實驗中，通過qRTPCR 技術(shù)檢測RORγt mRNA 和Foxp3 mRNA 的表達(dá)及采用ELISA 方法，檢測IL-10、IL-17、IL-6 的含量來反映脊髓缺血性再灌注損傷Th17/Treg 特異性轉(zhuǎn)錄因子動態(tài)演變及相關(guān)細(xì)胞因子的變化趨勢。在觀察的時間點內(nèi)，第3 天時Foxp3 mRNA 和RORγt mRNA的表達(dá)出現(xiàn)一個不對稱峰值時脊髓缺血再灌注損傷后細(xì)胞因子IL-10、IL-17、IL-6 出現(xiàn)在高峰期說明機(jī)體通過表達(dá)Foxp3 誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞分化Treg 細(xì)胞并促進(jìn)IL-10 的分泌發(fā)揮抗炎及免疫抑制的作用;促炎因子IL-17 是Th17 細(xì)胞標(biāo)志性的細(xì)胞因子，啟動炎癥的發(fā)生，促進(jìn)炎性介質(zhì)IL-6 的釋放加劇炎性反應(yīng)。在實驗中還觀察到第7 天呈Foxp3 mRNA 呈上升趨勢，與此同時RORγt mRNA 的表達(dá)在7 d 開始下降，而IL-6、IL-17 及IL-10 含量乃處于較高水平，這可能與脊髓缺血再灌注損傷的機(jī)制的復(fù)雜化有關(guān)，且隨著時間的延長，其他的相關(guān)因素參與到脊髓缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展環(huán)節(jié)中來，導(dǎo)致一系列機(jī)體病理生理及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的變化，從而導(dǎo)致器官的損傷和全身炎性反應(yīng)。

綜上所述，Treg 細(xì)胞與Th17 細(xì)胞發(fā)展的不平衡性在脊髓缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。這種穩(wěn)態(tài)的破壞既使免疫系統(tǒng)激活，又使免疫效應(yīng)不足，這種雙向變化，進(jìn)一步加劇了炎癥反應(yīng)，加劇了炎性反應(yīng)狀態(tài)的發(fā)展。這提示:調(diào)控Th17 細(xì)胞的活化并增強(qiáng)Treg 細(xì)胞的活性使其處于穩(wěn)態(tài)之中可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)和抑制炎癥反應(yīng)狀態(tài)的進(jìn)展，從而為脊髓缺血再灌注損傷的靶向治療提供了新的思路和線索。

［1］黃 飛，李亞男，尹 飛，等.脊髓缺血再灌注損傷對大鼠水通道蛋白4 表達(dá)的影響［J］.中國免疫學(xué)雜志，2013，29(5):495 -498.

［2］宋慶鑫，張 帆，王 琨，等.miRNA 在急性脊髓損傷病理生理調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用研究進(jìn)展［J］.中國脊柱脊髓雜志，2013，23(11):1022 -1024.

［3］Lu P，Wang M，Zheng P，et al.Th17/Treg unbalance is involved in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology，2014，30(10):1013 -1017.

［4］Ma L，Liang Y，F(xiàn)ang M，et al.The cytokines (IFN-gamma，IL-2，IL-4，IL-10，IL-17)and Treg cytokine (TGF-beta1)levels in adults with immune thrombocytopenia［J］.Die Pharmazie，2014，69(9):694 -697.

［5］劉貴香，姚平波，張 平，等.急性腦梗死患者外周血Th17 細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2014，35(7):1027 -1029.

［6］胡 聶，包 錚，王 松，等.嚴(yán)重胸部創(chuàng)傷患者外周血Th17/Treg平衡變化與預(yù)后的關(guān)系［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2014，35(7):1095 -1097.

［7］蔣福生，張 平，張新華，等.急性腦梗死患者免疫調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系［J］.中國動脈硬化雜志，2013，21(10):923 -926.

［8］金 華，郭光瓊，李艷華，等.脊髓缺血再灌注損傷模型的改進(jìn)及對大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2012，29(10):879 -882.

［9］Dong L，Wang X，Tan J，et al.Decreased expression of microRNA-21 correlates with the imbalance of Th17 and Treg cells in patients with rheumatoid arthritis［J］.J Cellular and Molecular Medicine，2014，28(10):1 -12.

［10］Nogueira LG，Santos RH，F(xiàn)iorelli AI，et al.Myocardial gene expression of T-bet，GATA-3，Ror-gammat，F(xiàn)oxP3，and hallmark cytokines in chronic Chagas disease cardiomyopathy:an essentially unopposed TH1-type response［J］.Mediators of Inflammation，2014，2014:914326.

［11］Edwards JP，Thornton AM，Shevach EM，et al.Release of active TGFbeta1 from the latent TGF-beta1/GARP complex on T regulatory cells is mediated by integrin beta8［J］.J Immunol，2014，193(6):2843 -2849.

［12］Hu R，Huffaker TB，Kagele DA，et al.MicroRNA-155 confers encephalogenic potential to Th17 cells by promoting effector gene expression［J］.J Immunol，2013，190(12):5972 -5980.