廖志敏，符家武，劉 根

動脈粥樣硬化性腦梗死(atherosclerotic cerebral infarction，ACI)是缺血性腦卒中最常見類型，病因主要包括動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病和血脂異常等，其中腦動脈粥樣硬化是ACI 發(fā)病的核心環(huán)節(jié)［1］。

近年來，許多研究表明縫隙連接蛋白40(connexin 40，Cx40)參與動脈粥樣硬化的發(fā)病機制。Cx40 廣泛表達于血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和心房心肌細胞等，其組成的縫隙連接跨膜通道在血管壁內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和基質(zhì)等相互間的電藕聯(lián)和代謝藕聯(lián)中發(fā)揮重要作用［2］。Chadjichristos 等［3］研究發(fā)現(xiàn)特異性敲除小鼠血管內(nèi)皮細胞Cx40 基因，可導致大量白細胞向血管內(nèi)膜黏附，進而促進小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)病。此外，Chu 等［4］報道了動脈粥樣硬化模型小鼠主動脈內(nèi)皮細胞的Cx40 基因表達下調(diào)，這表明Cx40 可能起著抑制動脈粥樣硬化形成的作用。

人Cx40 基因(又稱GJA5 基因)位于1 號染色體長臂2 區(qū)1 帶1 亞帶(1q21.1)，含有2 個啟動子區(qū)域和4 個外顯子［5］，主要編碼Cx40。2003 年，Groenewegen 等［6］在一個患有罕見家族性心房停滯的家族中首次報道了位于Cx40 基因啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點rs35594137(-44 G/A)。近年來，F(xiàn)irouzi 等［7］報道了Cx40 基因rs35594137 位點與荷蘭男性高加索人群的高血壓發(fā)病密切相關(guān)。Juang 等［8］研究發(fā)現(xiàn)rs35594137 位點A 等位基因顯著降低Cx40 基因啟動子活性，并且明顯增加臺灣人群心房顫動的發(fā)病風險?；诖耍狙芯恳詮V東漢族人群為研究對象，首次探討Cx40 基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點rs35594137 與ACI 易感性的相關(guān)性，并分析rs35594137 位點與Cx40 mRNA 相對表達水平的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2011 年12 月～2014 年1 月在我院神經(jīng)內(nèi)科連續(xù)住院的初發(fā)的ACI 患者(病例組)342 例，所有患者經(jīng)頭部MRI 或CT 檢查確診，并符合全國第四屆腦血管病學術(shù)會議通過的診斷標準［9］。排除標準:(1)過去及現(xiàn)在有過其他類型的缺血性卒中(主要根據(jù)TOAST 分型，如心源性腦栓塞、腔隙性腦梗死、其他明確病因或不明原因腦梗死);(2)腦出血病史;(3)心絞痛、心肌梗死和缺血性心肌病等嚴重冠心病史;(4)惡性腫瘤、自身免疫性疾病和嚴重感染等病史;(5)重大手術(shù)史。對照組選自于我院體檢中心同期進行體檢的健康者296 例。入組者均為廣東漢族人群，相互間無血緣關(guān)系。本研究經(jīng)廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準，入組者均簽署知情同意書。病例組和對照組的年齡、性別具有可比性，一般臨床資料(見表1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因型檢測 所有研究對象常規(guī)禁食12 h，并于清晨抽取外周靜脈血2 ml，血液樣本收集于枸櫞酸鈉(EDTA-Na)抗凝管，并采用DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取血液基因組DNA。病例組和對照組Cx40 基因啟動子區(qū)rs35594137 位點基因型檢測采用SNaPshot 技術(shù)(Applied Biosystems，USA)［10］，操作過程主要包括PCR 反應、單堿基延伸反應和多態(tài)性位點序列檢測，其中PCR 引物設(shè)計和合成均由上海天昊生物科技有限公司完成，上游引物序列:5’-CCCTCTTTTTAATCGTATCTGTGGC-3’;下游引物序列:5’-GGTGGAGGGAAGAAGACTTTTAG-3’。

1.2.2 單個核細胞總RNA 提取和熒光定量PCR 隨機選取50 例病例組患者和50 例對照組健康體檢者，均采集清晨空腹外周靜脈血2 ml，按照密度梯度離心法提取外周血單個核細胞，并根據(jù)TRIzol 法提取單個核細胞總RNA，總RNA 濃度和完整性檢測分別采用美國Nanodrop 公司的紫外分光光度計和變性瓊脂糖凝膠電泳方法。根據(jù)cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermal Scientificx)操作說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，外周血單個核細胞Cx40 mRNA 表達量檢測采用熒光定量PCR 方法，并以管家基因GADPH 作為內(nèi)參對結(jié)果進行標準化。熒光定量PCR 引物設(shè)計和合成均由上海天昊生物科技有限公司完成，其中Cx40 基因上游引物序列:5’-AAAAAGCGTGGGCAGTTGGAG-3’，Cx40 基因下游引物序列:5’-CCAGCACGAGCATACGGAATA-3’;GAPDH 基因上游引物序列:5’-GAAGGGCTCATGACCACAGTCCAT-3’，GAPDH 基因下游引物序列:5’-TCATTGTCGTACCAGGAAATGAGCTT-3’。每個cDNA 樣本重復3 次熒光定量PCR 檢測，采用2-ΔΔCt值計算Cx40 mRNA 相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用直接計數(shù)法計算兩組基因型和等位基因頻率;兩組的基因型和等位基因頻率分布比較、哈迪-溫伯格定律(Hardy-Weinburg equilibrium，HWE)檢測均采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法;計量資料采用均數(shù)±標準差()表示，組間均數(shù)比較采用t 檢驗。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0 軟件，均為雙側(cè)檢驗，其中P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 病例組吸煙率、高血壓患病率、2 型糖尿病患病率、空腹血糖、總膽固醇(CHOL)和低密度脂蛋白(LDL)明顯高于對照組，病例組高密度脂蛋白(HDL)明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(見表1)。

表1 病例組及對照組的一般臨床資料比較

2.2 各組Cx40 基因rs35594137 位點的基因型和等位基因頻率分布 病例組與對照組的Cx40基因rs35594137 位點基因型頻率分布均符合哈迪-溫伯格定律(P=0.88 和P=0.16)，群體代表性好。病例組rs35594137 位點的GG、AG 和AA 基因型頻率分別是38.6 %、47.4%和14.0%;對照組分別是48.6 %、44.6%和6.8%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(GG vs AG vs AA:P=0.003。顯性模型AA+AG vs GG:P=0.011;隱性模型AA vs AG+GG:P=0.003);病例組rs35594137 位點A 等位基因頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(37.7% vs 29.1%，P=0.001，OR=1.479，95%CI=1.169～1.871)(見表2)。

2.3 病例組和對照組Cx40 mRNA 表達水平的差異和rs35594137 位點多態(tài)性對Cx40 mRNA 相對表達水平的影響 隨機選取的50 例病例組ACI 患者外周血單個核細胞Cx40 mRNA 相對表達量明顯低于50 例對照組(約0.65 倍)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.001)(見圖1);對50 例對照組rs35594137位點的基因型與Cx40 mRNA 相對表達水平關(guān)系進一步分析，結(jié)果顯示AG +AA 基因型(A 等位基因攜帶者)的外周血單個核細胞Cx40 mRNA 相對表達量低于GG 基因型(約0.82 倍)，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.001)(見圖2)。

表2 兩組Cx40 基因rs35594137 位點基因型和等位基因頻率分布比較

3 討論

ACI 最常見病因是動脈粥樣硬化，腦動脈粥樣硬化性閉塞或血栓形成是導致ACI 發(fā)病的主要病理機制。目前認為，各細胞間相互的信息通訊失調(diào)是動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。而縫隙連接作為廣泛存在于哺乳類動物各種組織和細胞的一種允許相鄰細胞相互間進行信息物質(zhì)交換的細胞膜通道，在血管內(nèi)皮細胞損傷和血管平滑肌增生等病理過程中發(fā)揮重要作用，與動脈粥樣硬化的發(fā)病密切相關(guān)［11］。

近年來，已有動物實驗初步證實Cx40 可能起著抑制動脈粥樣硬化形成的作用。Cx40 基因單核苷酸多態(tài)性與多種心腦血管疾病易感性的相關(guān)性研究日趨增加。Juang 等［8］發(fā)現(xiàn)rs35594137 位點通過影響Cx40 基因啟動子活性，引起Cx40 基因表達下調(diào)，進而增加心房顫動的發(fā)病風險。而Pfenniger 等［12］報道了瑞士高加索人群Cx40 基因多態(tài)性位點rs35594137 與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病易感性無關(guān)。據(jù)我們所知，國內(nèi)外目前尚未見Cx40 基因多態(tài)性與ACI 易感性的相關(guān)研究報道。

本次研究發(fā)現(xiàn)吸煙、高血壓、2 型糖尿病以及高血脂(特別是CHOL 和LDL)是ACI 發(fā)病的危險因素，而HDL 是ACI 發(fā)病的保護因素。因此，戒煙，盡早控制血壓、血糖和糾正血脂異常可能是降低ACI發(fā)病率的有效干預措施。此外，病例組rs35594137位點的基因型頻率分布與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(顯性模型AA +AG vs GG:P=0.011，OR=1.507，95% CI=1.100～2.066);病例組rs35594137位點A 等位基因頻率明顯高于對照組(37.7 % vs 29.1 %，P=0.001，OR=1.479，95 %CI=1.169～1.871)。這表明A 等位基因攜帶者(AA +AG 基因型)可能增加ACI 發(fā)病的易感性。同時，我們發(fā)現(xiàn)病例組患者外周血單個核細胞Cx40 mRNA 相對表達量大約是對照組的0.65 倍;A 等位基因攜帶者外周血單個核細胞Cx40 mRNA 相對表達量大約是GG 基因型的0.82 倍，差異均有統(tǒng)計學意義。

圖1 病例組和對照組外周血單個核細胞Cx40 mRNA 相對表達水平比較

圖2 Cx40 基因rs35594137 位點不同基因型Cx40 mRNA 相對表達水平比較

基于此，我們推測rs35594137 位點的A 等位基因通過降低Cx40 基因啟動子活性，引起Cx40 mRNA表達下調(diào)和Cx40 蛋白合成減少，促進動脈粥樣硬化的形成，從而參與ACI 的發(fā)生與發(fā)展。值得一提的是，本次研究顯示廣東漢族健康對照人群rs35594137 位點A 等位基因頻率是29.1 %，與之前研究的臺灣人群［8］和北京漢族人群［13］結(jié)果相近(A等位基因頻率分別是28.5%和30.0%)，但明顯高于荷蘭高加索人群(A 等位基因頻率是20.0%)［7］。這表明Cx40 基因rs35594137 位點多態(tài)性具有種族差異性。綜上所述，Cx40 基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點rs35594137 與ACI 易感性相關(guān)，A 等位基因可能通過引起Cx40 基因表達下調(diào)成為ACI 發(fā)病的危險因素。然而，為了更加明確Cx40 基因多態(tài)性與ACI 易感性的關(guān)系，更大樣本量、不同種族人群和Cx40 基因其他多態(tài)性位點與ACI 的相關(guān)性研究需要進一步開展。

［1］王建平，豐宏林.動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病機制研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2013，19(17):3104 -3106.

［2］臧小彪，張樹龍.縫隙連接蛋白40 和心房顫動［J］.心血管病學進展，2011，32(4):554 -557.

［3］Chadjichristos CE，Scheckenbach KE，van Veen TA，et al.Endothelial-specific deletion of connexin40 promotes atherosclerosis by increasing CD73-dependent leukocyte adhesion［J］.Circulation，2010，121(1):123 -131.

［4］Chu PH，Yeh HI，Wu HH，et al.Deletion of the FHL2 gene attenuates the formation of atherosclerotic lesions after a cholesterol-enriched diet［J］.Life Sci，2010，86(9):365 -371.

［5］Sun Y，Tong X，Chen H，et al.An atrial-fibrillation-linked connexin40 mutant is retained in the endoplasmic reticulum and impairs the function of atrial gap-junction channels［J］.Dis Model Mech，2014，7(5):561 -569.

［6］Groenewegen WA，F(xiàn)irouzi M，Bezzina CR，et al.A cardiac sodium channel mutation cosegregates with a rare connexin40 genotype in familial atrial standstill［J］.Circ Res，2003，92(1):14 -22.

［7］Firouzi M，Kok B，Spiering W，et al.Polymorphisms in human connexin40 gene promoter are associated with increased risk of hypertension in men［J］.J Hypertens，2006，24(2):325 -330.

［8］Juang JM，Chern YR，Tsai CT，et al.The association of human connexin 40 genetic polymorphisms with atrial fibrillation［J］.Int J Cardiol，2007，116(1):107 -112.

［9］全國第四屆腦血管病學術(shù)會議標準(1995)［J］.中華神經(jīng)科雜志，1996，29(6):376 -381.

［10］Wei W，Luo HB，Yan J，et al.Exploring of new Y-chromosome SNP loci using Pyrosequencing and the SNaPshot methods［J］.Int J Legal Med，2012，126(6):825 -833.

［11］杜秋明，王存選，王 林.縫隙連接與心腦血管疾病關(guān)系的研究進展［J］.中國慢性病預防與控制，2012，20(4):474 -476.

［12］Pfenniger A，van der Laan SW，F(xiàn)oglia B，et al.Lack of association between connexin40 polymorphisms and coronary artery disease［J］.Atherosclerosis，2012，222(1):148 -153.

［13］周 琪，張 萍，李學斌，等.Connexin40 基因多態(tài)性與心房顫動的相關(guān)性研究［J］.臨床心電學雜志，2008，17(3):204 -206.