張會玲 ，李 崢，張晉霞，賀永貴，余 紅，李世英，劉 斌

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是作用最強、特異性最高的成血管因子，可以促進新生血管形成。存活素是新發(fā)現(xiàn)的作用最強的凋亡抑制蛋白。近年來，VEGF、存活素與腦缺血的關系日益受到關注。VEGF 通過上調(diào)存活素的表達發(fā)揮抗神經(jīng)細胞凋亡的作用［1］，存活素在VEGF 和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的調(diào)控下表達增加，促進血管生成［2］。本實驗觀察腦缺血預適應后再灌注不同時間點海馬CA1區(qū)VEGF、存活素的表達，探討腦缺血預適應的腦保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 雄性8 周齡SD 大鼠130 只，體重200～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。隨機分為SO 組(n=10)、MCAO 組(n=60)和BIP 組(n=60)，后兩組按缺血后再灌注時間不同分為再灌注2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 6 個亞組。兔抗VEGF 多克隆抗體、兔抗存活素多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);免疫組織化學試劑盒(pv-6001)(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司);β-actin 抗體(碧云天生物技術(shù)研究所);快速SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)。

1.2 模型制備 (1)BIP 組:10% 水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，頸部正中行縱行切口，暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)，分離頸內(nèi)動脈(ICA)、頸外動脈(ECA)。經(jīng)ECA-ICA 插入栓線，阻斷大腦中動脈起始部。以分叉處為標記，栓線插入深度為(18.0 ±0.5)mm，感覺到阻力時停止插線。缺血10 min 后拔出栓線形成再灌注，完成缺血預適應。24 h 后拆除皮膚縫線，再次分離CCA、ICA，栓線經(jīng)CCA-ICA 栓至大腦中動脈造成缺血2 h，拔出栓線形成第2 次再灌注，實現(xiàn)兩次缺血再灌注。(2)MCAO 組:除第一次栓線插入深度小于10 mm 外，余步驟同BIP 組。(3)SO 組:兩次栓線插入深度均小于10 mm。

1.3 免疫組化檢測 取前囪前1 mm 至前囪后2 mm 之間的腦組織切塊，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定，去離子水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，取厚度4 mm 冠狀腦組織切片。應用免疫組化二步法檢測VEGF、存活素陽性細胞的表達。首先在低倍鏡下選擇6 個視野，然后在高倍鏡下計數(shù)陽性細胞，取其平均數(shù)作為該大鼠陽性細胞的表達數(shù)量。

1.4 Western blot 檢測 成功麻醉大鼠，立即斷頭取腦，冰盤上快速剝離右側(cè)海馬區(qū)腦組織，-80 ℃冰箱中凍存。腦組織勻漿取上清，BCA 法行蛋白定量，上樣量50 μg，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，一抗工作液(1∶ 500)4 ℃孵育過夜，二抗工作液(1∶ 2000)室溫孵育2 h，ECL 試劑顯影。以β-actin 蛋白作為參照，按公式計算目的蛋白表達量=目的條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組VEGF、存活素陽性細胞表達VEGF、存活素陽性細胞呈棕黃色，主要表達于胞漿。SO 組有少量陽性細胞表達VEGF(5.27±0.45)、存活素(5.33±0.52)，兩者于缺血后再灌注2 h 表達即開始增多，24 h 表達至各時間高峰，隨后表達逐漸減少，72 h 表達仍維持在較高水平。BIP 組各時間點VEGF、存活素陽性細胞表達均高于MCAO 組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。兩組組內(nèi)各相鄰時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(見表1、表2)。

2.2 各組VEGF、存活素蛋白表達 SO 組VEGF、存活素蛋白表達少(0.31 ± 0.04，0.37 ±0.03)。兩者均于再灌注2 h 表達增加，24 h 表達至各時間點峰值。BIP 組各時間點VEGF、存活素表達均高于MCAO 組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。兩組組內(nèi)各相鄰時間點比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)(見表3、表4;見圖1～圖4)。

表1 各組海馬CA1區(qū)VEGF 陽性細胞數(shù)比較()

表1 各組海馬CA1區(qū)VEGF 陽性細胞數(shù)比較()

與MCAO 組比較△P ＜0.05;與同組上一時間點比較* P ＜0.05

表2 各組海馬CA1區(qū)存活素陽性細胞數(shù)比較()

與MCAO 組比較△P ＜0.05;與同組上一時間點比較* P ＜0.05

表3 各組海馬CA1區(qū)VEGF 蛋白表達比較()

與MCAO 組比較＊△P ＜0.05;與同組上一時間點比較* P ＜0.05

表4 各組海馬CA1區(qū)存活素蛋白表達比較()

表4 各組海馬CA1區(qū)存活素蛋白表達比較()

與MCAO 組比較△P ＜0.05;與同組上一時間點比較* P ＜0.05

圖1 MCAO 組VEGF 蛋白表達

圖2 BIP 組VEGF 蛋白表達

圖3 MCAO 組存活素蛋白表達

圖4 BIP 組存活素蛋白表達

3 討論

缺血性腦血管病主要是由于各種原因引起的腦部血液供應減少致微循環(huán)障礙，最終腦組織缺血缺氧發(fā)生壞死。因此，血管重建、改善微循環(huán)供血是缺血后的首要任務。VEGF 是促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂的生長因子，不僅能夠選擇性作用于內(nèi)皮細胞膜上的血管內(nèi)皮生長因子受體，誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，而且能夠增加內(nèi)皮細胞的間隙引起血漿蛋白外滲，誘導間質(zhì)產(chǎn)生［3］，從而促進血管新生，改善局部血液循環(huán)，延緩組織壞死［4］。Lu 等［5］利用基因轉(zhuǎn)移法發(fā)現(xiàn)VEGF 可以促進梗死周邊區(qū)新生血管的表達，12 h 開始出現(xiàn)，72 h 達到高峰。除此之外，VEGF 還能夠通過下調(diào)凋亡基因的表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用［6］。體外培養(yǎng)的細胞在無血清、低氧等環(huán)境中的存活率與VEGF 發(fā)揮抗凋亡作用密切相關［7］。叢麗等［8］通過腦缺血預適應誘導腦缺血耐受實驗觀察到，預適應組1 d、3 d、7 d 亞組腦梗死體積較非預適應組相應亞組明顯減小，提示腦缺血預適應誘導產(chǎn)生腦缺血耐受。本研究顯示，預缺血10 min 處理后，VEGF 表達較MCAO 組明顯增加，推測可能與腦缺血預適應的腦保護機制有關。

存活素被認為是目前最強大的凋亡抑制蛋白，能夠促進細胞增殖、有絲分裂，進而促進血管新生［9］。Conway 等［10］建立大鼠大腦中動脈閉塞模型發(fā)現(xiàn)，再灌注48 h 梗死灶周邊區(qū)可見新生血管，血管內(nèi)皮細胞中存活素顯著表達，且存活素的表達量與微血管生成密度呈正相關，提示存活素參與了血管的生成。Zhang 等［11］建立低氧預適應的腦缺血耐受模型，發(fā)現(xiàn)預先給予低氧預適應的細胞存活素的表達明顯高于對照組，且細胞生存率提高了50%，說明存活素參與腦缺血耐受的發(fā)生。另有研究證實，存活素可以調(diào)控癌細胞自我吞噬［12］。

目前關于VEGF、存活素兩者關系的報道集中在腫瘤疾病的研究中，而在腦血管病方面少見報道。李秋玲等［13］建立永久性大鼠腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)VEGF 和存活素在時空表達上具有協(xié)同性，表達高峰在2 w 左右，主要表達在大腦皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及血管內(nèi)皮細胞。本研究結(jié)果顯示，缺血后腦組織VEGF 和存活素的表達增加，且二者表達趨勢一致。缺血側(cè)海馬CA1區(qū)VEGF 和存活素的表達隨缺血再灌注時間延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，再灌注24 h 表達至各時間點最高水平，提示VEGF和存活素在表達部位及表達時間上具有一致性。Marti 等［14］制備嚙齒類動物的大腦中動脈閉塞模型觀察缺血后腦組織血管新生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VEGF 能上調(diào)存活素的表達，而且是調(diào)控存活素表達的重要因子，二者在血管新生過程中發(fā)揮重要作用。目前研究認為，VEGF 通過上調(diào)存活素表達實現(xiàn)抗凋亡作用，而存活素作為血管生成中的保護性基因，能夠在VEGF、bFGF 的調(diào)控下表達增加，促進細胞增殖和血管生長。

本研究給予預缺血10 min 處理后，觀察到VEGF 和存活素的表達被進一步上調(diào)，推測腦缺血預適應通過促進兩者的表達發(fā)揮腦保護作用。

綜上所述，腦缺血預適應能促進VEGF、存活素的表達上調(diào)，兩者相互促進，協(xié)調(diào)發(fā)揮腦保護作用，這為研究腦缺血預適應的腦保護機制提供了新的思路。

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