張峻嶺，王琳，趙俊芳，張丹丹，劉曉潔

（1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；2.天津市第五中心醫(yī)院，天津 300450；3.天津市河西區(qū)婦產(chǎn)醫(yī)院，天津 300202）

白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的由于黑素細(xì)胞特發(fā)性損害而致的后天性色素脫失性皮膚病，發(fā)病率約為0.1%～2%[1]，近年有逐漸增高趨勢(shì)。白癜風(fēng)的病因尚不明確，近年來(lái)的大量研究支持了白癜風(fēng)是一種自身免疫相關(guān)性疾病。白斑顆粒Ⅰ號(hào)方作為院內(nèi)制劑治療氣滯血瘀型白癜風(fēng)應(yīng)用30 余年，取得了滿(mǎn)意的臨床效果，但具體作用機(jī)制不明，早有研究證實(shí)某些中藥可以調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。本研究通過(guò)觀(guān)察白斑顆粒Ⅰ號(hào)方對(duì)白癜風(fēng)患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）Foxp3mRNA 表達(dá)的影響，來(lái)探討白斑顆粒Ⅰ號(hào)方對(duì)白癜風(fēng)患者的免疫調(diào)節(jié)作用，以助于揭示白斑Ⅰ號(hào)方可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例來(lái)源 收集本院皮膚科普通門(mén)診及色素性皮膚病專(zhuān)病門(mén)診的尋常型進(jìn)展期白癜風(fēng)患者60例，中醫(yī)證型均為氣滯血瘀證，隨機(jī)分為2 組，試驗(yàn)組30 例，男17 例，女13 例，平均年齡（27.93±15.31）歲，平均病程（23.46±51.36）個(gè)月；對(duì)照組30例，男14 例，女16 例，平均年齡（33.56±20.52）歲，平均病程（20.18±40.97）個(gè)月；健康對(duì)照組30 例，男15 例，女15 例，平均年齡（30.45±18.32）歲；試驗(yàn)組與對(duì)照組在性別、年齡和病程上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——白駁風(fēng)診斷依據(jù)、證候分類(lèi)、療效評(píng)定》[2]；西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照趙辨《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》中白癜風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)；分型分期參照中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)會(huì)色素病學(xué)組有關(guān)白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)（2003 年修訂稿）[3]。

1.2 中藥制劑和儀器 本院院內(nèi)制劑白斑顆粒Ⅰ號(hào)方（津藥制字Z20070008）；RG-3000 熒光定量PCR 儀（澳大利亞Corbett Research 公司）；、Trizol 試劑(天津潤(rùn)泰科技發(fā)展有限公司）、引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。TIANScript cDNA 第一鏈合成試劑盒，RealMasterMix（SYBR Green I）試劑盒，DNA Marker 均購(gòu)自天津博敏達(dá)生物科技有限公司。

1.3 分組及給藥方法 氣滯血瘀型白癜風(fēng)患者隨機(jī)分為2 組，試驗(yàn)組30 例，給予口服白斑顆粒Ⅰ號(hào)方3 g，2 次/d，轉(zhuǎn)移因子膠囊（成都利爾藥業(yè)有限公司）6 mg，2 次/d，外用糠酸莫米松（面部除外），1 次/d，或0.1%他克莫司（面部），2 次/d，治療3 個(gè)月；對(duì)照組30 例，轉(zhuǎn)移因子膠囊6 mg，2 次/d，單純外用糠酸莫米松（面部除外），1 次/d，或0.1%他克莫司（面部），2 次/d，療程3 個(gè)月。

1.4 方法

1.4.1 分離PBMC 取試驗(yàn)組、對(duì)照組治療前、后及健康對(duì)照組肝素抗凝外周血5 mL，PBS 稀釋?zhuān)馨图?xì)胞分離液（Ficoll）分離出單個(gè)核細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞至1×109/L。

1.4.2 樣本總RNA 提取及cDNA 的合成 按TRIzol 試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行單核細(xì)胞（MNCs）總RNA 提取，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 的質(zhì)量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄步驟按照Transcript cDNA 第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，吸光度掃描計(jì)算總RNA 濃度。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)檢測(cè)Foxp3 mRNA表達(dá)水平 參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，F(xiàn)oxp3 引物序列如下：上游：5′-gCTgggAAAATggCACTgAC-3′，下游：5′-gTT TCCATggCTACCCCACA-3′，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度443 bp；內(nèi) 參GAPDH 序 列 上 游：5′-CACCATCTTCCAgg AgCgAg-3′，下游：5′-AAATgAgCCCCAGgCCTTCTC-3′，預(yù)計(jì)產(chǎn)物長(zhǎng)度261 bp。反應(yīng)條件為95 ℃變性10 s、62 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，50 個(gè)循環(huán)。應(yīng)用RG-3000 熒光定量PCR 儀（澳大利亞Corbett Research Sydney 公司）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程。Foxp3mRNA 表達(dá)相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法處理數(shù)據(jù)[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料呈正態(tài)分布分別以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。2 組樣本間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 白癜風(fēng)患者組與健康對(duì)照組PBMC 中Foxp3 mRNA 表達(dá)量的比較 白癜風(fēng)患者組（n=60）與健康對(duì)照組（n=30），F(xiàn)oxp3 mRNA（2-△△CT）表達(dá)量分別為（0.380±0.027）和1，2 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=33.77，P<0.05）。

2.2 試驗(yàn)組與對(duì)照組治療前后Foxp3 mRNA 的表達(dá)量的比較

2.2.1 試驗(yàn)組治療3 個(gè)月后Foxp3 mRNA 的表達(dá)量高于治療前的Foxp3 mRNA 的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=39.71，P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2.2 對(duì)照組治療3 個(gè)月后Foxp3 mRNA 的表達(dá)量高于治療前的Foxp3 mRNA 的表達(dá)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=54.79，P<0.05）。

2.2.3 治療3 個(gè)月后，試驗(yàn)組治療前后外周血Foxp3 mRNA 的表達(dá)升高值高于對(duì)照組治療前后外周血Foxp3 mRNA 的表達(dá)升高值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.26，P<0.05）。

表1 治療前、后Foxp3 mRNA(2-△△Ct)表達(dá)量比較 （x±s）

3 討論

Foxp3 稱(chēng)叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，屬于轉(zhuǎn)錄因子forkhead/winged-helix 家族，是調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞發(fā)育和功能維持的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，是Treg 細(xì)胞的特征性標(biāo)志，對(duì)Treg 的發(fā)育和功能起著關(guān)鍵作用，編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子Foxp3[6]。最近的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 特異性高表達(dá)在胸腺和外周CD4+CD25+調(diào)節(jié)T 細(xì)胞表面，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的活化同時(shí)伴有細(xì)胞中Foxp3 表達(dá)的增加，其表達(dá)水平與CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的抑制活性有關(guān)[7]。Foxp3 的缺乏可以損害自我耐受和免疫調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致嚴(yán)重的自身免疫性疾病[8]。

白癜風(fēng)患者CD4+CD25+Treg 細(xì)胞數(shù)量的減少或功能的缺陷，CD4+CD25+Treg 細(xì)胞數(shù)量的減少，同時(shí)伴有細(xì)胞內(nèi)Foxp3 表達(dá)的降低，F(xiàn)oxp3 的異常與細(xì)胞的抑制功能異常有關(guān)，提示與白癜風(fēng)CD4+CD25+T細(xì)胞的功能異常和發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[9]。這在一定程度上導(dǎo)致其免疫抑制功能受損，使自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活，同時(shí)B 細(xì)胞活化、增殖、產(chǎn)生抗黑素細(xì)胞抗體，機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能紊亂，促進(jìn)了黑素細(xì)胞的破壞，這可能為白癜風(fēng)一種可能的發(fā)病機(jī)制。本研究表明，尋常型進(jìn)展期白癜風(fēng)患者與健康對(duì)照組比較PBMC Foxp3 mRNA 表達(dá)量顯著下降。白癜風(fēng)患者由于處于免疫失衡狀態(tài)，細(xì)胞免疫尤其是Treg 細(xì)胞可能參與了白癜風(fēng)的發(fā)病。

白斑顆粒Ⅰ號(hào)方為著名中西醫(yī)結(jié)合皮膚病學(xué)專(zhuān)家邊天羽教授根據(jù)經(jīng)典方劑“通竅活血湯”加減化裁而來(lái)，成為院內(nèi)制劑（津藥制字Z20070008），臨床應(yīng)用多年，用于氣滯血瘀證的患者，聯(lián)合外用激素治療，取得滿(mǎn)意效果，可有效控制白癜風(fēng)的發(fā)展，提高療效，縮短外用激素時(shí)間，減少激素不良反應(yīng)。方中主要有紅花、防風(fēng)、桃仁、大棗、川芎、生姜、蔥白、赤芍、補(bǔ)骨脂、白芷組成，具有補(bǔ)益脾腎、行氣活血、祛風(fēng)通絡(luò)的功效。方中補(bǔ)骨脂補(bǔ)益脾腎，取腎為先天之本腎藏精，脾為后天之本氣血生化之源，脾腎同補(bǔ)，精血互生。川芎、赤芍共用行氣活血，桃仁、紅花活血通絡(luò)，蔥姜通陽(yáng)，防風(fēng)、白芷祛風(fēng)，又兼走表，直接作用于發(fā)病部位，佐以大棗益氣和中。

本研究探討Foxp3 基因白癜風(fēng)患者治療前后差異表達(dá)發(fā)現(xiàn)，尋常型進(jìn)展期白癜風(fēng)患者與健康對(duì)照組比較PBMC Foxp3 mRNA 顯著下降。白癜風(fēng)試驗(yàn)組治療后患者PBMC 中Foxp3 mRNA 水平顯著升高，接近正常水平，與治療前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,說(shuō)明經(jīng)過(guò)有效治療，隨著CD4+CD25+Treg細(xì)胞Foxp3 mRNA 表達(dá)水平的升高，白癜風(fēng)患者CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能得到恢復(fù)，抑制自身反應(yīng)性T 細(xì)胞活性和功能加強(qiáng)，使患者的病情得到緩解。說(shuō)明白斑顆粒Ⅰ號(hào)方可以通過(guò)糾正患者的調(diào)節(jié)T 細(xì)胞功能，使Foxp3 轉(zhuǎn)錄因子水平恢復(fù)或接近正常水平，達(dá)到調(diào)節(jié)免疫功能的作用，起到治療白癜風(fēng)的目的。

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