王 玲，王開金，黎 聯(lián)△,黎曉強，李 敏

(1.四川省自貢市第一人民醫(yī)院急診科 643000；2.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科 402260；3.重慶市江津區(qū)呼吸疾病研究所 402260；4.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院病理科 402260)

?

·論 著·

基質(zhì)金屬蛋白酶-9與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子在肺腺癌中的表達*

王 玲1，王開金2,3，黎 聯(lián)2,3△,黎曉強2,3，李 敏3,4

(1.四川省自貢市第一人民醫(yī)院急診科 643000；2.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科 402260；3.重慶市江津區(qū)呼吸疾病研究所 402260；4.重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院病理科 402260)

目的 研究基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)在肺腺癌表達的相關(guān)性及意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)(SP)法檢測MMP-9、VEGF在30例肺腺癌組織和12例癌旁正常組織中的表達。Western blot 檢測MMP-9單克隆抗體阻斷MMP-9后肺腺癌A549細(xì)胞VEGF蛋白表達水平的變化，以及VEGF克隆抗體阻斷VEGF后肺腺癌A549細(xì)胞MMP-9蛋白表達水平的變化。結(jié)果 MMP-9在腺癌組織表達率為63.3%，正常組織表達率為16.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；VEGF在腺癌組織表達率為70%，正常組織表達率為25%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肺腺癌組織MMP-9水平與VEGF表達率存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.709 4,P<0.01)，并與肺腺癌的臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移狀況相關(guān)(P<0.05)。VEGF高表達率與肺腺癌的臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移狀況相關(guān)(P<0.05)。用MMP-9單克隆抗體阻斷MMP-9可降低VEGF蛋白表達水平，用VEGF單克隆抗體阻斷VEGF可降低MMP-9蛋白表達水平。結(jié)論 VEGF、MMP-9在肺腺癌高表達，在促進腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中具有協(xié)同作用。

肺腺癌； 基質(zhì)金屬蛋白酶-9； 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是目前已知最重要的促血管生成因子之一，與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是一種與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白酶，與血管形成過程中基底膜的降解關(guān)系密切。許多實驗發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織MMP-9、VEGF高表達，與淋巴轉(zhuǎn)移及分期等密切相關(guān)，但二者在肺癌的報道較少，兩者在促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的相互關(guān)系亦不清楚。本試驗選取30例肺腺癌及12例癌旁正常組織標(biāo)本，應(yīng)用免疫組化方法檢測VEGF、MMP-9表達。體外培養(yǎng)腺癌A549，分別加MMP-9、 VEGF單克隆抗體后檢測VEGF、MMP-9的蛋白表達變化，以探討二者在促進肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院30例肺腺癌患者手術(shù)切除的肺癌標(biāo)本(2009年3月至2012年3月)，12例癌旁正常組織。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。30例肺腺癌患者中，男∶女為20∶10，年齡范圍40～82歲，>60歲14例，≤60歲的16例；病灶超過3 cm的18例，病灶小于或等于3 cm的12例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例；所有病例術(shù)前未行放化療，均有完整的病歷資料；據(jù)美國聯(lián)合癌癥分類委員會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2002年制定的肺癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[1]：Ⅰ～Ⅱ期13例，Ⅲ～Ⅳ期17例。

1.2 細(xì)胞系 人肺腺癌A549由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所已有的細(xì)胞復(fù)蘇而得，細(xì)胞在37 ℃、5%CO2、含10% 小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，0.1%胰酶消化傳代。

1.3 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司，胎牛血清購自天津TBD公司，鼠抗人MMP-9、VEGF單克隆抗體(mAb)購自Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠、鼠抗人β-actin多克隆抗體、S-P超敏免疫組化試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 免疫組織化學(xué) 按照免疫組化試劑盒說明書步驟進行MMP-9(1∶50)、VEGF(1∶50)免疫組化染色，設(shè)正常肺組織對照組，同時用與一抗相應(yīng)的免疫前血清IgG代替一抗作為陰性對照，用已知陽性的切片作陽性對照，結(jié)果判定參考黎聯(lián)等[2]的方法。0～1分為低表達組，≥2分為高表達組。

1.5 蛋白質(zhì)印跡 細(xì)胞傳代穩(wěn)定后分為3個組：A549，A549+MMP-9 mAb(5 μg/mL)，A549+VEGF mAb (5 μg/mL)。待培養(yǎng)的細(xì)胞至90%匯合狀態(tài)時，用4 ℃的PBS沖洗細(xì)胞兩次,加入裂解液200 μL，冰上振蕩30 min,用細(xì)胞刮充分刮取細(xì)胞，離心提取上清總蛋白，按1∶4加上樣緩沖液后水煮沸3～5 min，EP管分裝凍存。用Bradford法測蛋白濃度。以每孔40 μg蛋白上樣，8%SDS-PAGE電泳分離，濕式電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，一抗(抗VEGF、MMP-9)用TBST按1∶500稀釋，4 ℃孵育過夜，相應(yīng)二抗37 ℃孵育1.5 h，化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測條帶，β-actin作內(nèi)參照，試驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 SAS8.2統(tǒng)計軟件，行Fisher確切概率法，Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-9、VEGF在腺癌組織中的表達及相關(guān)性 免疫組化結(jié)果顯示，MMP-9蛋白主要位于癌細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，高表達組占63.3%(19/30)，正常組織表達率16.7%(2/12)；VEGF蛋白主要位于癌細(xì)胞胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，高表達組占70%(21/30)，正常組織表達率25%(3/12)(圖1)。在21例VEGF高表達病例中MMP-9高表達18例，而9例VEGF低表達病例中MMP-9高表達只有1例，MMP-9與VEGF表達呈明顯正相關(guān)(r=0.709 4,P<0.01)。

2.2 肺腺癌組織MMP-9、VEGF表達與臨床病理特征的關(guān)系 統(tǒng)計結(jié)果顯示，MMP-9、VEGF表達水平在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，在Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)；MMP-9、VEGF表達與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

2.3 MMP-9單克隆抗體阻斷MMP-9后肺腺癌細(xì)胞VEGF蛋白表達的變化 終濃度5 μg/mL的MMP-9 mAb處理A549細(xì)胞24 h后，Western blot檢測顯示，VEGF蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)(圖2)。

注：A為MMP-9的表達，B為VEGF的表達。

圖1 MMP-9和VEGF在肺腺癌組織的表達(SP，×200) 表1 MMP-9、VEGF表達與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

注：1指MMP-9 mAb濃度是0 μg/mL；2指MMP-9 mAb濃度是5 μg/mL。

圖2 MMP-9 mAb處理A549細(xì)胞24 h后VEGF蛋白表達

2.4 VEGF單克隆抗體阻斷VEGF后肺腺癌細(xì)胞MMP-9蛋白表達的變化 終濃度5 μg/mL的VEGF mAb處理A549細(xì)胞24 h后，Western blot檢測顯示，MMP-9蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)(圖3)。

注：1指VEGF mAb濃度是0 μg/mL；2指VEGF mAb濃度是5 μg/mL。

圖3 VEGF mAb處理A549細(xì)胞24 h后MMP-9蛋白表達

3 討 論

現(xiàn)已知VEGF作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進毛細(xì)血管的形成，并對新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞具有強烈的抗凋亡作用，在腫瘤的血管形成中具有核心作用。對胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn)VEGF在癌組織的表達明顯升高，與淋巴轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)[3-4]。研究還發(fā)現(xiàn)肺癌組織中的VEGF表達顯著高于良性及正常組織，癌組織中VEGF表達陽性者的微血管密度顯著高于陰性者，腺癌組織中VEGF表達程度比鱗癌組織顯著增高，這也許就是腺癌更易早期轉(zhuǎn)移、進展迅速的原因之一[5-6]。

MMP-9通過降解和破壞細(xì)胞基質(zhì)中最重要的Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠，以利于腫瘤血管向間質(zhì)生長，腫瘤血管的微血管密度不斷增加，腫瘤不斷增長并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在多種癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。對胰腺癌的研究表明VEGF、MMP-9在癌組織中的平均表達水平高于正常組織中的表達，提示VEGF、MMP-9與胰腺癌的發(fā)生相關(guān)，MMP-9、VEGF的表達與胰腺癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，表明MMP-9、VEGF在胰腺癌轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，二者大體保持同步的變化[7-8]。本研究也發(fā)現(xiàn)MMP-9、VEGF在肺腺癌高表達，與淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)，二者表達呈正相關(guān)。

MMP-9、VEGF在癌癥發(fā)展中同步增高，二者之間的關(guān)系如何？Meadows等[9]研究發(fā)現(xiàn)VEGF可以激活通過RAS活化ERK通路，乳腺癌細(xì)胞及肝細(xì)胞肝癌的細(xì)胞中ERK信號途徑的活化能使MMP-9基因轉(zhuǎn)錄，乳腺癌細(xì)胞中ERK可活化MMP-9，ERK 抑制劑PD 98059劑量依賴性抑制MMP-9表達，表明MMP-9可能是ERK 信號途徑的下游分子。本研究發(fā)現(xiàn)阻斷VEGF后MMP-9明顯下降，表明肺腺癌中ERK信號通路調(diào)控MMP-9的表達。李貞等[10]研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001可以明顯抑制鼠視網(wǎng)膜新生血管，明顯下調(diào)VEGF的表達，猜測可能是抑制了MMP-9，減弱了MMP-9分解細(xì)胞外基質(zhì)，從而減少了VEGF釋放。為了研究二者之間的相互作用關(guān)系，本研究體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞進行Western blot 檢測顯示A549細(xì)胞有VEGF和MMP-9表達，單克隆抗體阻斷MMP-9后，VEGF的表達明顯下降；單克隆抗體阻斷VEGF后MMP-9也明顯下降，表明VEGF和MMP-9存在相互促進表達的作用。

由此可見，VEGF和MMP-9除了可以促進癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移外，二者之間存在相互刺激促進的信號途徑，這樣就構(gòu)成了一個正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，促進肺癌血管增生、細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，但其中確切機制仍不清楚，而深入研究二者之間的調(diào)控機制，有助于對肺腺癌生長、浸潤和轉(zhuǎn)移機制的進一步認(rèn)識，最終為肺腺癌的診斷、治療和預(yù)后評價提供重要幫助。

[1]王吉耀．內(nèi)科學(xué)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：124-125．

[2]黎聯(lián)，梅同華，周向東，等．基質(zhì)金屬蛋白酶26蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達及其意義[J]．癌癥，2009，28(1)：76-81．

[3]Tang RF，Itakura J，Aikawa T，et al．Overexpression of lymphangiogenic growth factor VEGF-C in human pancreatic cancer[J]．Pancreas，2001，22(3)：285-292.

[4]Bogoevski D，Yekebas EF,Schurr D，et al．Mode of spread in the early phase of lymphatic metastasis in pancreatic ductal adenocarcinoma：prognostic significance of nodal microinvolvement[J]．Ann Surg，2004，240(6)：993-1000.

[5]McDonnell CO，Hill ADK，McNamara DA，et al．Tumor micrometastases：The influence of angiogenesis[J]．Eur J Surg Oncol，2000，26(2)：105-115．

[6]葉超然．血管內(nèi)皮生長因子在非小細(xì)胞肺癌的表達及其意義[J]．廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2001，18(4)：478-479．

[7]Nagakawa Y，Aoki T，Kasuya K，et al．Histologic features of venous invasion,expression of vascular endothelial growth factor and m atrixmetalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9,and the relation with liver metastasis in pancreatic cancer[J]．Pancreas，2002，24(2)：169-178．

[8]李春龍，崔云甫，杜雪飛，等.VEGF和MMP-9在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的表達及臨床意義[J].世界華人消化雜志，2008，16(9)：1012-1016.

[9]Meadows KN,Bryant P,Pumiglia K.Vascular endothelial growth factor induction of the angiogenic phenotype requires ras activation[J].J Biol Chem,2001，276(52)：49289-49298.

[10]李貞，施彩虹，倪衛(wèi)杰.基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001對鼠視網(wǎng)膜新生血管和VEGF表達的作用[J].上海交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2008，28(6):665-668.

Study on expression of MMP-9 and VEGF in lung adenocarcinoma*

WANGLing1,WANGKai-jin2,3,LILian2,3△,LIXiao-qiang2,3,LIMin3,4

(1.DepartmentofEmergency,ZigongMunicipalFirstPeople′sHospital,Zigong,Sichuan643000,China;2.DepartmentofRespiratoryMedicine,JiangjinDistrictCentralHospital,Chongqing402260,China;3.JiangjinDistrictInstituteofRespiratoryDiseases,Chongqing402260,China;4.DepartmentofPathology,JiangjinDistrictCentralHospital,Chongqing402260,China)

Objective To investigate the correlation between matrix metalloprotoinase-9(MMP-9) and vascular endothelial growth factor(VEGF) expressions in lung adenocarcinoma and its significance.Methods The immunohistochemistry (SP) was used to test the expressions of MMP-9 and VEGF in 30 specimens of lung adenocarcinoma and 12 specimens of normal paracancerous lung tissues.Western blot was used to detect the change of VEGF protein levels in lung adenocarcinoma A549 cells after blocking MMP-9 by MMP-9 mAb,and the change of MMP-9 protein levels in lung adenocarcinoma A549 cells after blocking VEGF by VEGF mAb.Results The high expression rate of MMP-9 protein in lung adenocarcinoma tissues was 63.3%,which in the normal tissues was 16.7%,the difference had statistical significance(P<0.05);the high expression rate of VEGF protein in lung adenocarcinoma tissues was 70%,which in the normal tissues was 25%,the difference had statistical significance(P<0.05);the high expression rate of MMP-9 in the lung adenocarcinoma was positively correlated with the high expression rate of VEGF(r=0.709 4,P<0.01),and which was correlated with the lymph node metastasis status and the clinical TNM stage(P<0.05).The high expression rate of VEGF was correlated with the lymph node metastasis status and the clinical TNM stage(P<0.05).Blocking MMP-9 by MMP-9 mAb could reduce the VEGF protein expression level.Blocking VEGF by VEGF mAb could reduce the MMP-9 protein expression level.Conclusion VEGF and MMP-9 are highly expressed in lung adenocarcinoma and have the synergistic action in promoting invasion and metastasis of lung adenocarcinoma.

lung adenocarcinoma； MMP-9； VEGF

重慶市自然科學(xué)基金面上項目(cstc2011jjA0961)。

王玲，女，本科，主治醫(yī)師，主要從事呼吸疾病研究?！?/p>

，E-mail:lilian19700925@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.009

A

1672-9455(2015)02-0161-03

2014-05-29

2014-10-25)