雷 黎，劉 淼，沈際佳△

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,合肥 230061;2.安徽醫(yī)科大學(xué)

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·論 著·

日本血吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的克隆與表達(dá)*

雷 黎1，劉 淼2，沈際佳2△

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,合肥 230061;2.安徽醫(yī)科大學(xué)

病原生物學(xué)教研室,合肥 230032)

目的 獲得日本血吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的原核表達(dá)蛋白。方法 根據(jù)GenBank中日本血吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑的序列設(shè)計(jì)引物，以cDNA為模板聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增該基因，將其亞克隆入原核表達(dá)載體pET28a中，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。結(jié)果 成功克隆了具有完整開放閱讀框的日本血吸蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑重組質(zhì)粒，獲得相對(duì)分子質(zhì)量約44×103的目的蛋白。結(jié)論 成功地克隆表達(dá)了絲氨酸蛋白酶抑制劑，為進(jìn)一步研究該蛋白的特性、功能及免疫保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。

日本血吸蟲； 絲氨酸蛋白酶抑制劑; 克??； 表達(dá)

在人類寄生蟲病中，就社會(huì)經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生重要性而言，血吸蟲病是僅次于瘧疾的第二重要的熱帶病，是一種嚴(yán)重威脅人民健康的人畜共患寄生蟲性傳染病，在我國(guó)仍然是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題[1]。因而通過免疫方法繼續(xù)尋找新的血吸蟲抗原分子是非常必要的。作者根據(jù)GenBank中公布的絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)的序列設(shè)計(jì)引物，克隆表達(dá)了SPI,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 BL-21大腸埃希菌、表達(dá)載體pET28a由本室保存?？寺≥d體pMD18-T、各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) Marker、蛋白質(zhì)低分子量的標(biāo)準(zhǔn)品、Tris堿、明膠均購自大連寶生物工程有限公司； 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自杭州V-gene生物工程有限公司；其他試劑是國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 日本血吸蟲SPI基因的體外擴(kuò)增 根據(jù)SPI基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，序列為Primer1:5′-GAA TTC ATG GCA CCA AAA GTT CAA G-3′；Primer2:5′-CTC GAG TTA TAA CAT TGG ATT GAT T-3′。兩條引物分別引入限制性的內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以日本血吸蟲cDNA為模板，PCR反應(yīng)條件為 94 ℃5 min熱啟動(dòng)，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，1%瓊脂糖電泳分析。PCR產(chǎn)物膠回收按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 日本血吸蟲SPI基因的克隆與鑒定 將PCR擴(kuò)增的SPI基因與T載體相連,然后轉(zhuǎn)化XL1-blue；第2天，提取質(zhì)粒,經(jīng)XhoⅠ和ECORⅠ雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶。將表達(dá)載體pET28a用同樣的兩個(gè)酶進(jìn)行酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶,再與已經(jīng)回收的SPI的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化BL-21,涂含有卡那霉素的LB平板；第2天，從平板中挑取10個(gè)單個(gè)菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，用經(jīng)XhoⅠ和ECORⅠ雙酶切鑒定,1%瓊脂糖凝膠電泳。將酶切鑒定正確的克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 日本血吸蟲SPI的表達(dá) 將酶切與測(cè)序鑒定正確的克隆，加入到含卡那霉素的3 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；再按1∶50的比例擴(kuò)大培養(yǎng)約3 h，使OD600為0.6左右時(shí)，留取1 mL的菌液；剩余的菌液中加入1 mol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在加入IPTG后5 h、12 h收集1 mL的菌液，再將所有收集的菌液均作同樣的處理，4 000 r/min離心5 min，每管中加入30 mL的無菌水重懸細(xì)菌和30 mL的2×蛋白上樣緩沖液，沸水浴中煮沸10 min以裂解細(xì)菌，4 000 r/min離心5 min，采用12%凝膠,不連續(xù)緩沖系統(tǒng),通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),濃縮膠55 V 1 h、分離膠110 V 1.5 h，考馬氏亮藍(lán)染色1 h,搖振脫色過夜，觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 日本血吸蟲SPI的PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增后,1%瓊脂糖電泳后可以見到約1 200 bp大小的條帶,與理論值一致,見圖1。

注：1為SPI的PCR產(chǎn)物，M為DNA標(biāo)記物。

圖1 SPI的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 日本血吸蟲SPI的重組體的酶切鑒定結(jié)果 提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，1%瓊脂糖電泳可見大小兩條帶，可見1 200 bp左右的目的條帶出現(xiàn),與理論大小一致，結(jié)果見圖2。

注：1為重組體的酶切鑒切，M為DNA標(biāo)記物。

圖2 SPI的酶切鑒定結(jié)果

2.3 序列分析結(jié)果 將測(cè)序結(jié)果分別與GenBank進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示本研究克隆入表達(dá)載體中的序列為日本血吸蟲SPI，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 日本血吸蟲SPI的表達(dá)(SDS-PAGE) SDS-PAGE結(jié)果顯示,在沒有加入IPTG誘導(dǎo)時(shí),未見明顯特異性條帶出現(xiàn),在加入IPTG后的5 h和12 h后,在相對(duì)分子質(zhì)量44×103處可見有明顯條帶出現(xiàn)，與理論值大小相符(圖3)。

注：1為未加IPTG；2為加入IPTG后5 h；3為加入IPTG后12 h,M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物。

圖3 SPI表達(dá)的SDS-PAGE圖

3 討 論

日本血吸蟲生活史復(fù)雜，有性生殖和無性繁殖交替，中間宿主和終末宿主轉(zhuǎn)換[2]，血吸蟲在演化過程中蟲體內(nèi)仍具有許多種、屬間及各期間高度保守的基因，已知這些高度保守基因序列及其產(chǎn)物在生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖及血吸蟲與宿主相互關(guān)系中發(fā)揮著重要作用，在蟲體的信號(hào)傳遞、細(xì)胞分化與增殖、蛋白質(zhì)相互作用和宿主免疫誘導(dǎo)反應(yīng)等生理生命活動(dòng)中也是至關(guān)重要的。

本實(shí)驗(yàn)室在運(yùn)用對(duì)血吸蟲感染有抗性的血清免疫學(xué)方法篩選日本血吸蟲童蟲cDNA文庫時(shí),在25個(gè)陽性克隆中，其中就有2個(gè)為日本血吸蟲SPI[3]。而閻玉濤等[4]用對(duì)血吸蟲感染存在天然抗性的東方田鼠的血清篩選日本血吸蟲成蟲cDNA 文庫時(shí)發(fā)現(xiàn)，所篩選出的51個(gè)陽性克隆中有10個(gè)為含日本血吸蟲SPI基因的陽性克隆，可見血吸蟲SPI與血吸蟲的免疫逃避機(jī)制明顯相關(guān)。

SPI屬于絲氨酸蛋白酶超家族，此家族是一類具有共同來源及結(jié)構(gòu)序列高度同源的蛋白酶抑制劑家族[3]。這個(gè)家族已發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個(gè)成員，廣泛分布于動(dòng)物、植物體和病毒粒子中。SPI具有多種功能，可作為酶的抑制劑起作用，如抑制絲氨酸蛋白酶的活性、抑制纖溶酶原激活劑的活性等。對(duì)血吸蟲SPI的功能研究較少,Lim 等[5]發(fā)現(xiàn)，小鼠先注射非肽類SPI，然后進(jìn)行尾蚴攻擊感染，可使小鼠獲得80%的減蟲率和92%的減卵率。很多學(xué)者認(rèn)為，血吸蟲本身SPI的作用在于該抑制劑與血吸蟲的絲氨酸蛋白酶共價(jià)結(jié)合后，封閉了絲氨酸蛋白酶的表位，該復(fù)合物中絲氨酸蛋白酶的免疫原性消失；同時(shí)該抑制劑可抑制嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白從而抑制嗜中性粒細(xì)胞對(duì)寄生于體內(nèi)血吸蟲的攻擊。

本研究以日本血吸蟲cDNA為模板，選擇不含任何多克隆酶切位點(diǎn)的T載體，當(dāng)PCR產(chǎn)物在與T載體相連后，轉(zhuǎn)化細(xì)菌,提取質(zhì)粒,然后使用PCR引物中引入的限制性內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物酶切下來,不僅極大地提高了PCR產(chǎn)物酶切效率，而且克服了直接酶切,膠回收PCR產(chǎn)物引起的損失,大大提高了PCR產(chǎn)物與相應(yīng)載體的連接效率，并將其亞克隆入原核表達(dá)載體pET28a中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白——SPI。SPI是一類從病毒到人類均有分布的蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量較大，通常由300～500個(gè)氨基酸殘基組成。它含有8～9個(gè)α-螺旋、3個(gè)β-折疊組成的保守三級(jí)結(jié)構(gòu)，功能域位于C端，有一個(gè)暴露于蛋白主體外的反應(yīng)中心環(huán)(RCL)，其與抑制蛋白酶的種類和活性密切相關(guān)。其中，RCL上的P1位點(diǎn)氨基酸殘基決定了抑制蛋白酶的特異性，SPI可在細(xì)胞內(nèi)也可分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用，它主要參與寄生蟲與宿主的相互作用，可作用于宿主酶利于蟲體獲取營(yíng)養(yǎng)，或抵抗宿主酶對(duì)蟲體的損傷，或參與調(diào)控宿主的炎癥及免疫應(yīng)答[6]。重組表達(dá)獲得血吸蟲SPI，為進(jìn)一步研究日本血吸蟲SPI的特性、功能及免疫保護(hù)作用，深入了解血吸蟲適應(yīng)宿主體及對(duì)宿主致病的分子機(jī)制，發(fā)展基于抑制劑靶點(diǎn)干預(yù)的血吸蟲病防治藥物提供參考,也為尋找血吸蟲新保護(hù)性候選疫苗分子的研究提供了新思路。

[1]袁忠英,沈玉娟,曹建平.等.東方田鼠血清免疫篩選日本血吸蟲童蟲cDNA文庫及新基因分析[J].中國(guó)血吸蟲病防治雜志,2008,20(4)：255-259.

[2]楊燕萍,郭素霞,陳晶,等.編碼日本血吸蟲Argonaute蛋白全長(zhǎng)cDNA克隆、表達(dá)及初步鑒定[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2010，26(9):830-834. [3]任翠平,王曉楠,雷黎,等.血吸蟲感染抗性人血清篩選日本血吸蟲童蟲eDNA文庫[J].中國(guó)地方病學(xué)雜志,2007,26(5)：490-493.

[4]閻玉濤,劉述先,宋光承,等.東方田鼠天然抗體相關(guān)的日本血吸蟲抗原基因篩選和克隆[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,2001,19(3)：153-156.

[5]Lim KC,Sun E,Bahgat M,et al． Block-age of skin invasion by schistosome cercariae by serine protease inhibitors [J]．Am J Trop Med Hyg,1999,60(3):487-492．

[6]李暉,彭禮飛.寄生線蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑研究進(jìn)展[J].國(guó)際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志,2011,39(6):344-349.

Cloning and expressing of Schistosoma japonicums serine protease inhibitor*

LEILi1,LIUMiao2,SHENJi-jia2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei,Anhui230061,China;2.ResearchandTeachingSectionofPathogenicBiology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230032,China)

Objective To obtain Schistosoma japonicums serine protease inhibitor(SPI) prokaryotic express protein.Methods The primer was designed on the basis of sequence of Schistosoma japonicum SPI in Genbank,the PCR method was used to amplify the gene with cDNA as the template.Then the product was subcloned into prokaryotic expression vector pET28a,IPTG induced to express the recombination protein.Results The Schistosoma japonicums SPI recombinant plasmid with complete patency reading frame was successfully cloned and the interest protein with the relative molecular mass 44×103was obtained.Conclusion SPI is successfully cloned and expressed,which lays the foundation for the further study of the protein′s character,function and immunoprotection effect.

Schistosoma japonicum; serine protease inhibitor; clone; express

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(050430805)。

雷黎，男，副主任技師，碩士研究生，日本血吸蟲分子免疫學(xué)，主要從事臨床分子免疫學(xué)工作。

△通訊作者，E-mail：shenjijia@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.02.004

A

1672-9455(2015)02-0151-02

2014-05-22

2014-11-06)