劉辰庚，張躍其，王金玲，王培昌(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053)

?

·論 著·

外吐小體內(nèi)microRNA-193b在阿爾茨海默病患者中的檢測(cè)*

劉辰庚，張躍其，王金玲，王培昌△(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100053)

目的 初步探討microRNA-193b(miR-193b)作為阿爾茨海默病(AD)生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。方法 使用超速離心法提取癡呆期AD(DAT)患者和輕度認(rèn)知障礙(MCI)患者和健康對(duì)照組血清和腦脊液外吐小體并檢測(cè)其miR-193b水平。結(jié)果 MCI和DAT患者腦脊液及血清外吐小體內(nèi)miR-193b水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，且DAT組低于MCI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 腦脊液和血清外吐小體內(nèi)miR-193b可能為AD，特別是早期診斷AD的標(biāo)志物。

阿爾茨海默??； 外吐小體； 微小RNA； 生物標(biāo)志物

阿爾茨海默病(AD)是老年癡呆癥中最為重要和常見的類型[1]。研究表明外吐小體內(nèi)microRNA(miR)有作為疾病生物標(biāo)志物的價(jià)值，且可能參與了細(xì)胞間的信號(hào)傳遞。本研究在前期研究的提示下，使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)AD患者血清和腦脊液中外吐小體內(nèi)和總體miR-193b的水平，初步探索外吐小體內(nèi)miR-193b作為AD生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值[2]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年11月本院收治的AD患者共79例，其中輕度認(rèn)知障礙期患者(MCI)43例，男25例，年齡中位數(shù)63歲；女18例，年齡中位數(shù)65歲。癡呆期患者(DAT)36例，男21例，年齡中位數(shù)72歲；女15例，年齡中位數(shù)75歲。MCI和DAT的診斷符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院國(guó)立老化研究所和AD協(xié)會(huì)于2011年4月聯(lián)合發(fā)布，并經(jīng)我國(guó)神經(jīng)內(nèi)科學(xué)會(huì)推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。另隨機(jī)選取性別、年齡匹配的健康者作為對(duì)照組。本研究?jī)?nèi)容已通過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集 受試者空腹12 h后分別使用肝素抗凝管和促凝管采集靜脈血，抽血后1 h內(nèi)以3 000 r/min離心7 min，分離血漿或血清。男性患者8例(3例MCI，5例DAT)抽血后1 h內(nèi)由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)生按照操作規(guī)程抽取腦脊液標(biāo)本2 mL。標(biāo)本在分析前保存于液氮中。

1.3 外吐小體提取 液氮中取出的標(biāo)本分別置于-80、-20和4 ℃冰箱0.5 h緩慢復(fù)融，之后立即轉(zhuǎn)入玻璃試管。使用預(yù)冷的磷酸鹽(PBS)緩沖液將標(biāo)本1∶1稀釋，4 ℃條件下3 000 r/min離心15 min；將上清轉(zhuǎn)移至超速離心管中，避免混入沉淀以防止細(xì)胞碎片污染；之后4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min；小心吸出上清液，4 ℃條件下110 000 r/min離心1 h；棄上清液，加入5 mL預(yù)冷的PBS液并充分混勻；使用0.22 μm濾器過濾混合液；4 ℃條件下110 000 r/min離心30 min；棄上清液，加入5 mL預(yù)冷的PBS液，混勻后4 ℃條件下110 000 r/min離心30 min；棄上清液，加入100 μL預(yù)冷的PBS液重懸沉淀，即為外吐小體混合液[4]。

1.4 小RNA提取及miR-193b測(cè)定 使用天根公司(TIANGEN)miRcute miR親和柱提取小RNA，按說明書操作。每100 μL外吐小體PBS溶液加入100 μL裂解液，純化好的小RNA溶解于10 μL RNase-Free dd H2O 中；同時(shí)，提取腦脊液和血清標(biāo)本中的總小RNA。20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系中含RNA模板0.4 ng，RT Primer Mix 4 μL，5×RT Buffer 4 μL，RNase inhibitor 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 2 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL。20 μL miR檢測(cè)體系中含miR cDNA 1.0 μL，2×SYBR Green Mix 10.0 μL，相應(yīng)上、下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，25 s；62 ℃，35 s；72 ℃，25 s，35個(gè)循環(huán)。以Ce_miR-39為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法計(jì)算并統(tǒng)計(jì)miR-193b組間表達(dá)的差異[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用One-Way ANOVA分析，相同患者不同標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的組間比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清、血漿標(biāo)本相關(guān)性分析 同一受試者血清標(biāo)本中總體miR-193b和外吐小體內(nèi)miR-193b均略高于血漿，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中對(duì)照4例，MCI 3例，DAT 3例；2種標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均有相關(guān)性(r2=0.987)。見圖1。

注：1～4為對(duì)照組標(biāo)本，5～7為MCI組標(biāo)本，8～10為DAT組標(biāo)本。

圖1 同一受試者血清(A)和血漿(B)標(biāo)本中總體miR- 193b和外吐小體內(nèi)miR-193b的比較(n=10)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與MCI組比較，#P<0.05。

圖2 MCI和DAT患者腦脊液總體miR-193b和 外吐小體內(nèi)miR-193b水平檢測(cè)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與MCI組比較，#P<0.05。

圖3 MCI和DAT患者血清總體miR-193b和 外吐小體內(nèi)miR-193b水平檢測(cè)

2.2 腦脊液標(biāo)本檢測(cè) MCI和DAT患者腦脊液總體miR-193b水平均低于對(duì)照組(P<0.05)，但MCI和DAT患者組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MCI和DAT患者腦脊液外吐小體內(nèi)miR-193b水平均低于對(duì)照組，且DAT組低于MCI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 血清標(biāo)本檢測(cè) MCI和DAT患者血清總體miR-193b水平與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，MCI和DAT患者組間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MCI和DAT患者血清外吐小體內(nèi)miR-193b水平均低于對(duì)照組，且DAT組低于MCI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討 論

隨著研究的不斷深入，miR在AD發(fā)生和發(fā)展中的作用被更多地揭示，越來越多的研究結(jié)果提示相關(guān)miR表達(dá)的失控可能在AD中扮演了重要角色。miR在疾病中的改變主要包括在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)；參與miR轉(zhuǎn)錄后加工相關(guān)因子的表達(dá)失控而導(dǎo)致的miR轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)；以及miR基因的突變等。隨著芯片技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的不斷進(jìn)步和檢測(cè)成本的不斷降低，已有越來越多的研究著眼于探索miR這一潛在的疾病標(biāo)志物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并被miR Base數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的人類miR分子已近2 000種，其中絕大部分的miR分子在不同病理和生理狀況下都有表達(dá)，并且多數(shù)miR能夠在人體液中檢出[6-8]。

目前可能應(yīng)用于AD診斷的標(biāo)志物主要是蛋白類標(biāo)志物，例如tau蛋白、p-tau蛋白、t-tau蛋白和BACE-1酶活性等，如前所述，這些蛋白在腦脊液中的陽性率和陰性率較為滿意，但在血液標(biāo)本中則不甚理想。雖然腦脊液的生化改變較好地反映腦組織病理生理改變，但由于血腦屏障的存在，能進(jìn)入外周血的生物大分子的數(shù)量遠(yuǎn)少于其在腦脊液中的數(shù)量，使得豐度較低的腦源性標(biāo)志物即使在血液中發(fā)生改變也難以被有效地檢出。而對(duì)于AD患者，特別是pre-MCI和MCI患者而言，對(duì)其進(jìn)行CSF檢查往往得不到患者的理解，故尋找血液、尿液等更易獲得的體液標(biāo)本中的AD標(biāo)志物尤為關(guān)鍵。循環(huán)miR具有作為生物標(biāo)志物的幾大優(yōu)勢(shì)：首先，它們?cè)谘褐心芊€(wěn)定地存在，離體后也能在血液標(biāo)本中保存較長(zhǎng)時(shí)間，且其受pH值、溫度變化、反復(fù)凍融等影響較小[9]。其次，大多數(shù)miR在種屬間較為保守，這使得大部分在動(dòng)物模型上初步發(fā)現(xiàn)的潛在miR標(biāo)志物在人體內(nèi)也能被檢測(cè)到。第三，以現(xiàn)在的分子生物學(xué)技術(shù)，大部分實(shí)驗(yàn)室均能較好地進(jìn)行血液標(biāo)本miR的分離和定量檢測(cè)[10]。

困擾研究者的一大問題是miR的來源——相應(yīng)miR的改變是不是疾病特異性的，是否受到健康組織正常代謝的影響。另外，目前認(rèn)為體液中的miR除和一些蛋白結(jié)合而免于被降解之外，還能存在于外吐小體和微囊泡中。有學(xué)者甚至認(rèn)為，細(xì)胞就是以外吐小體和微囊泡形式對(duì)外分泌miR，這些外吐小體和微囊泡可能包含了分泌細(xì)胞要傳達(dá)給外界的信息[11]。事實(shí)上，Benner[12]早在1988年就曾提出“細(xì)胞外通訊RNA”假說，并認(rèn)為細(xì)胞外RNA在細(xì)胞增殖和分化中起重要作用。已有研究證實(shí)組成血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞能分泌微囊泡，但其是否能分泌外吐小體目前尚未見報(bào)道[13-14]。本研究結(jié)果提示，miR-193b在血清中的存在形式可能有2種——外吐小體內(nèi)和外吐小體外，且miR-193b在腦脊液和外周血之間的轉(zhuǎn)移很可能主要以外吐小體為載體；換言之，組成血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞也能夠分泌外吐小體，這種含有不同濃度miR的外吐小體很可能包含了腦組織向外周組織所傳遞的信息。

本研究結(jié)果表明，MCI和DAT患者血清總體miR-193b的檢測(cè)結(jié)果與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而當(dāng)提取外吐小體檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，外吐小體內(nèi)的miR-193b在MCI和DAT患者中均出現(xiàn)了明顯變化，且MCI患者血清外吐小體內(nèi)miR-193b明顯低于DAT患者，提示外吐小體內(nèi)miR-193b可能有助于AD的診斷，特別是早期診斷。結(jié)合腦脊液檢測(cè)結(jié)果，不難發(fā)現(xiàn)血清外吐小體內(nèi)miR-193b的降低的原因之一可能是腦脊液向外周血分泌的外吐小體內(nèi)miR-193b水平的降低。

綜上所述，血清外吐小體內(nèi)miR-193b可能為AD，特別是早期診斷AD的標(biāo)志物。

[1]Henriksen K,O′Bryant SE,Hampel H,et al.The future of blood-based biomarkers for Alzheimer′s disease[J].Alzheimers Dement，2014,10(1):115-131.

[2]Liu CG,Wang JL,Li L,et al.MicroRNA-135a and-200b,potential Biomarkers for Alzheimer′s disease,regulate β secretase and amyloid precursor protein[J].Brain Res，2014,(1583):55-64.

[3]賈建平,陸璐,張逸馳,等.美國(guó)國(guó)立老化研究所與阿爾茨海默癥協(xié)會(huì)診斷指南寫作組:阿爾茨海默癥源性輕度認(rèn)知障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)推薦[J].中華神經(jīng)內(nèi)科雜志，2012,45(5):345-351.

[4]Schageman J,Zeringer E,Li M,et al.The complete exosome workflow solution:from isolation to characterization of RNA cargo[J].Biomed Res Int,2013,2013(6):643-653.

[5]Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method[J].Methods，2001，25(4):402-408.

[6]Junn E,Mouradian MM.MicroRNAs in neurodegenerative diseases and their therapeutic potential[J].Pharmacol Ther,2012,133(2):142-150.

[7]Blennow K,Hampel H,Weiner M,et al.Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease[J].Nat Rev Neurol,2010,6(3):131-144.

[8]Rembach A,Faux NG,Watt AD,et al.Changes in plasma amyloid beta in a longitudinal study of aging and Alzheimer′s disease[J].Alzheimers Dement,2014,10(1):53-61.

[9]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(30):10513-10518.

[10]Yu JT,Liu QY,Tan L,et al.Circulating miR-125b as a biomarker of Alzheimer′s disease[J].J Neurol Sci,2014,336(1/2):52-56.

[11]Kooijmans SA,Vader P,Van Dommelen SM,et al.Exosome mimetics:a novel class of drug delivery systems[J].Int J Nanomedicine,2012,7(9):1525-1541.

[12]Benner SA.Extracellular communicator RNA[J].FEBS Lett,1988,233(2):225-228.

[13]Dommelen SM,Vader P,Lakhal S,et al.Microvesicles and exosomes:opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery[J].J Control Release,2012,161(2):635-644.

[14]Lee TH,D′Asti E,Magnus N,et al.Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular debris[J].Semin Immunopathol,2011,33(5):455-467.

Detection of exosomal microRNA-193b in patients of Alzheimer′s disease*

LIUChen-geng,ZHANGYue-qi,WANGJin-ling,WANGPei-chang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China)

Objective To evaluate the potential value of microRNA-193b(miR-193b) as a biomarker in Alzheimer′s disease(AD).Methods The super centrifugation method was adopted to extract the exosome from serum and cerebrospinal fluid and the level of exosomal miR-193b was detected in the patients with mild cognitive impairment(MCI),patients with dementia of Alzheimer′s type(DAT) and healthy control group.Results The exosomal miR-193b levels in cerebrospinal fluid of the patients with MCI and DAT were significantly higher than that of the control(P<0.05),moreover the DAT group was lower than the MCI group(P<0.05).The exosomal miR-193b levels in serum of the patients with MCI and DAT were significantly lower than that of the control group(P<0.05).Conclusion The exosomal miR-193b in serum and cerebrospinal fluid may be a potential biomarker of AD,especially for its early stage.

Alzheimer′s disease; exosome; microRNA; biomarker

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(81401734)；教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(20121107110001)。

劉辰庚，男，主管技師/講師，博士，主要從事衰老和相關(guān)疾病標(biāo)志物篩選方面的研究?！?/p>

，E-mail:pcw1905@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.002

A

1672-9455(2015)16-2301-03

2015-02-10

2015-05-10)