袁若愚，季伙燕，王建新，孟舒婷，王惠民,2Δ(.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 22600； 2.南通大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇南通 22600)

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·論 著·

乳酸脫氫酶催化活性濃度測(cè)量的不確定度評(píng)定*

袁若愚1，季伙燕1，王建新1，孟舒婷1，王惠民1,2Δ(1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南通 226001； 2.南通大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇南通 226001)

目的 評(píng)定在乳酸脫氫酶(LDH)催化活性濃度測(cè)量中不同廠家或批號(hào)試劑的不確定度。方法 配制不同廠家或批號(hào)LDH試劑，用國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)參考方法分別檢測(cè)中值和高值兩個(gè)濃度的混合血清，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，計(jì)算不同廠家或批號(hào)試劑間的不確定度。結(jié)果P<0.05表示對(duì)不同廠家或批號(hào)LDH試劑，所測(cè)LDH催化活性濃度結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同試劑批號(hào)對(duì)中值和高值混合血清的擴(kuò)展不確定度U分別為6.52%(k=2)和6.78%(k=2)。結(jié)論 不同廠家或批號(hào)試劑對(duì)LDH催化活性測(cè)量有影響，因此，在進(jìn)行不確定度評(píng)定時(shí)，應(yīng)考慮不同廠家或批號(hào)試劑的影響。

LDH催化活性濃度； 乳酸鋰鹽； N-甲基-D-葡糖胺； 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸

國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IFCC)推薦的乳酸脫氫酶(LDH)催化活性濃度測(cè)量方法為手工法，其所需試劑原材料為乳酸鋰鹽、N-甲基-D-葡糖胺、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、NAD二水合鋰鹽，但未規(guī)定所使用各試劑的生產(chǎn)廠家及批號(hào)。每年參加國(guó)際參考實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(RELA計(jì)劃)的國(guó)內(nèi)外參考實(shí)驗(yàn)室或候選參考實(shí)驗(yàn)室達(dá)數(shù)十家，各參考實(shí)驗(yàn)室均使用IFCC推薦的參考方法，但對(duì)相同樣本中LDH催化活性濃度的測(cè)量結(jié)果仍存在差異[1-2]。本實(shí)驗(yàn)比較不同廠家或批號(hào)試劑對(duì)LDH催化活性濃度的影響，評(píng)估其不確定度，作為實(shí)驗(yàn)室評(píng)估測(cè)量結(jié)果不確定度時(shí)的參考[3-4]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)導(dǎo)則34，選取南通大學(xué)附屬醫(yī)院中、高2種濃度LDH混合血清(中值濃度范圍為100～235 U/L，高值濃度范圍為360～800 U/L)，先后采用0.45 μm孔徑和0.22 μm孔徑的醋酸纖維素濾菌膜過(guò)濾分裝，置-70 ℃保存[5-6]。

1.2 儀器與試劑 儀器：日本日立公司U-3310紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；意大利Hanna公司HI98183型pH計(jì)；美國(guó)Fluke公司1521點(diǎn)式溫度計(jì)；德國(guó)SartoriusBT25S電子天平；德國(guó)Eppendorf reference移液器；北京格瑞恩公司DKB-501A型超級(jí)恒溫水槽。分光光度計(jì)、天平、pH計(jì)、溫度計(jì)和移液器均由南通市計(jì)量檢定測(cè)試所檢定，分光光度計(jì)、天平、pH計(jì)使用前均進(jìn)行校正。試劑：乳酸鋰鹽分別購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)1為SLBC8966V，批號(hào)2為060M5441)、蘇州亞科化學(xué)試劑股份有限公司(YK2014010801)、日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社(TCIWTTCL-LL)、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)1為T20100310，批號(hào)2為T20110104)、德國(guó)Applichem公司(8R004802)。N-甲基-D-葡糖胺分別購(gòu)自Sigma公司(批號(hào)1為SLBD8581V，批號(hào)2為SLBD4908V)、阿拉丁試劑(中國(guó))有限公司(34759)、日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社(批號(hào)1為34GFKPB，批號(hào)2為A877EHL)。NAD分別購(gòu)自Sigma公司(021M7015V)、國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(20131121)、阿拉丁試劑(中國(guó))有限公司(39720)、美國(guó)Amresco公司(批號(hào)1為0090C423，批號(hào)2為1071C303)。NAD二合水鋰鹽購(gòu)自Sigma公司(SLBB8328V)。

1.3 方法 應(yīng)用IFCC參考測(cè)量程序，在日立U-3310紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的反應(yīng)杯內(nèi)加入2.000 mL反應(yīng)液和0.100 mL混合血清標(biāo)本，完全混合并孵育180 s，在180 s末加入0.200 mL的起始反應(yīng)液，延滯90 s，測(cè)量180 s內(nèi)吸光度變化率，計(jì)算LDH催化活性[7]。用參考方法對(duì)上述收集的中值和高值混合血清分別進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)廠家或批號(hào)試劑分別測(cè)量中值和高值混合血清各5次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同廠家或批號(hào)試劑間的不確定度的計(jì)算參照下列公式進(jìn)行。

擴(kuò)展不確定度 U=k·uc

2 結(jié) 果

2.1 不同廠家或批號(hào)試劑測(cè)定LDH活性統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較 不同廠家或批號(hào)乳酸鋰鹽、N-甲基-D-葡糖胺與NAD測(cè)定LDH催化活性濃度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 不同廠家或批號(hào)試劑配對(duì)t檢驗(yàn)分析 為了判斷各廠家或批號(hào)試劑對(duì)LDH催化活性濃度的影響是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，采用SPSS19.0軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，測(cè)定LDH催化活性濃度的乳酸鋰鹽、N-甲基-D-葡糖胺與NAD廠家或批號(hào)的兩兩比較結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 不同廠家或批號(hào)試劑測(cè)定LDH活性統(tǒng)計(jì)結(jié)果比較

2.3 不同廠家或批號(hào)試劑間的不確定度評(píng)定結(jié)果 根據(jù)貝塞爾公式，分別計(jì)算不同廠家或批號(hào)乳酸鋰鹽的不確定度結(jié)果為u(中值) 3.34 U/L和u(高值) 8.93 U/L，相對(duì)不確定度結(jié)果為urel(中值) 1.91%和urel(高值) 1.69%；不同廠家或批號(hào)N-甲基-D-葡糖胺的不確定度結(jié)果為u(中值) 2.26 U/L和u(高值) 9.30 U/L，相對(duì)不確定度結(jié)果為urel(中值) 1.29%和urel(高值) 1.78%；不同廠家或批號(hào)NAD的不確定度結(jié)果為u(中值) 4.02 U/L和u(高值) 12.28 U/L，相對(duì)不確定度結(jié)果為urel(中值) 2.31%和urel(高值) 2.35%。根據(jù)以上所得的相對(duì)不確定度，計(jì)算不同廠家或批號(hào)的LDH試劑對(duì)中值和高值混合血清的合成不確定度和擴(kuò)展不確定度。

中值：

高值：

表2 不同廠家或批號(hào)試劑配對(duì)t檢驗(yàn)分析

3 討 論

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)評(píng)定在LDH催化活性濃度測(cè)量中不同廠家或批號(hào)試劑的不確定度方面的研究還較少。本研究比較不同廠家或批號(hào)試劑對(duì)LDH催化活性濃度的影響，結(jié)果表明對(duì)不同廠家或批號(hào)LDH試劑，所測(cè)LDH催化活性濃度結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。計(jì)算得到不同試劑批號(hào)對(duì)中值和高值混合血清的合成不確定度uc分別為3.26%和3.39%，擴(kuò)展不確定度U為分別為6.52%(k=2)和6.78%(k=2)。

本研究所得結(jié)果與德國(guó)臨床化學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)——參考實(shí)驗(yàn)室2(DGKL-Rf2)所提供的試劑批號(hào)所引起的不確定度1.24%相比有所差異，可能是由于本實(shí)驗(yàn)室所用的試劑廠家及批號(hào)與DGKL-Rf2所用的不同所引起的。所以，本研究在評(píng)定不同廠家或批號(hào)試劑對(duì)LDH催化活性濃度所引起的不確定度時(shí)，應(yīng)結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，不宜直接引用其他參考實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)。

因此，在進(jìn)行不確定度評(píng)定時(shí)，應(yīng)考慮不同廠家批號(hào)試劑對(duì)其的影響；在進(jìn)行校準(zhǔn)和測(cè)量能力的評(píng)定時(shí)，也應(yīng)考慮不同試劑廠家批號(hào)的影響。在今后工作中可以增加不同試劑廠家或批號(hào)數(shù)目，同時(shí)測(cè)量多個(gè)酶的催化活性濃度，進(jìn)行長(zhǎng)期研究，積累更多的數(shù)據(jù)，為參考實(shí)驗(yàn)室評(píng)估測(cè)量結(jié)果不確定度時(shí)提供參考[9]。

[1]遲珊,沈默,張曼.谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶國(guó)際室間比對(duì)計(jì)劃結(jié)果分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,26(8):540-543.

[2]楊振華.建設(shè)我國(guó)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)參考體系任重道遠(yuǎn)[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2012,30(10):734-736.

[3]Mauris G,Lasserre V,Foulloy L. A fuzzy approach for the expression of uncertainty in measurement[J].Measurement,2001,29(3):165-177.

[4]陳寶榮,孫慧穎,邵燕,等.基于“實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)”的臨床酶學(xué)參考方法測(cè)量不確定度評(píng)價(jià)模型的建立[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2011,29(5):327-330．

[5]Westwood S,King B,Noble B.Implementation of ISO Guide 34:Accreditation for reference material production.Accredit Qual Assur,2003,8(9):424-427.

[6]沈蕾,王建新,季伙燕,等.常規(guī)法測(cè)定不同GGT催化活性的不確定度評(píng)定[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2011,29(9):650-652.

[7]Schumann G,Bonora R,Ceriotti F,et al.IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 degrees C.Part 3.Reference procedure for the measurement of catalytic concentration of lactate dehydrogenase[J].Clin Chem Lab Med，2002,40(6):643-648.

[8]BIPM,IEC,IFCC,ISO,IUPAC,IUPAP,OIML.Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM)[M]．1st ed．Switzerland:International Organization for Standardization，2008:1-7．

[9]汪靜,張傳寶,居漪,等.國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)酶學(xué)測(cè)定參考方法實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)的初步建立[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,31(3):258-263.

Estimation on measurement uncertainty of lactate dehydrogenase catalytic activity concentration*

YUANRuo-yu1,JIHuo-yan1,WANGJian-xin1,MENGShu-ting1,WANGHui-min1,2△

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine，HospitalAffiliatedtoNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China;2.InstituteofLaboratoryMedicine，NantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China)

Objective To evaluate the measurement uncertainty of lactate dehydrogenase(LDH) catalytic activity concentration with different manufacturers or different lot numbers.Methods The LDH reagents with different manufacturers or different lot numbers were prepared.The pooled serum with low or high concentrations was measured by the reference method recommended by International Federation of Clinical Chemistry and laboratory medicine(IFCC)．The experimental data were analyzed by paired t test.The measurement uncertainty of lactate dehydrogenase with different manufacturers or different lot numbers was calculated.ResultsP<0.05 indicated that the differences of detected LDH catalytic activity concentrations results for different manufacturers or lot numbers of LDH reagents had statistical significance.The expanded uncertainty (U) of different manufacturers or lot numbers of reagents were 6.52%(k=2) for low concentration and 6.78%(k=2) for high concentration.Conclusion Different manufacturers or different lot numbers of reagents have significant effect on the catalytic activity concentrations of LDH.Therefore,in the detection of measurement uncertainty,the impact of different manufacturers or different lot numbers of reagents should be considered.

LDH catalytic activity concentrations; lithium lactate; N-methyl-D-glucamine； nicotinamide adenine dinucleotide

國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目(201210066);南通市科技項(xiàng)目(HS2012009)。

袁若愚，女，在讀碩士，主要從事生物化學(xué)及酶學(xué)檢驗(yàn)方面的研究?！?/p>

，E-mail:whm_jyk@ntu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.003

A

1672-9455(2015)16-2304-03

2015-02-25

2015-04-20)